结构及计算分析揭示SB225002通过优先削弱微管蛋白侧向相互作用导致微管去稳定

《Journal of Biological Chemistry》：Microtubule destabilization by SB225002 through preferential weakening of lateral tubulin interactions revealed by structural and computational analyses

　　

微管（microtubules）对细胞分裂和细胞内信号传导至关重要，因而已成为抗癌治疗（anticancer therapy）的成熟靶点。然而，传统微管靶向药物（microtubule-targeting agents, MTAs）的临床应用常受毒性及耐药性限制。SB225002最初被鉴定为白细胞介素-8受体（interleukin-8 receptor）拮抗剂，已有报道其可破坏微管动力学（microtubule dynamics），并在临床前研究中以相对较低的毒性表现出抗癌活性。然而，其与微管蛋白（tubulin）相互作用的结构基础仍知之甚少。在此，研究人员以2.60 ?分辨率解析了SB225002–微管蛋白复合物的晶体结构（crystal structure），并开展分子动力学模拟（molecular dynamics simulations, MD），以表征配体结合（ligand binding）以及药物诱导的微管蛋白结构和亚基间相互作用（inter-subunit interactions）变化。晶体结构显示，三个SB225002分子占据微管蛋白的秋水仙碱（colchicine, COL）和长春碱（vinblastine, VLB）结合区域。模拟显示，在模拟时间尺度内配体持续结合，纵向亚基间相互作用总体变化相对有限，而β-微管蛋白（β-tubulin）侧向界面相关表面的结构柔性（structural flexibility）和动态耦合（dynamic coupling）被优先改变。进一步纳入侧向和纵向微管蛋白界面的模拟显示，药物结合后侧向亚基间接触的减少大于纵向。总之，这些结果支持一种机制：SB225002优先扰动侧向微管蛋白相互作用，并为理解其微管调节活性提供了结构框架。

研究背景与问题：微管（microtubules）是细胞骨架的重要组分，参与有丝分裂、细胞内运输和信号整合，因此微管蛋白（tubulin）长期是抗癌药物发现的重要靶点。临床上，紫杉醇（paclitaxel）和长春碱（vinblastine, VLB）等微管靶向药物（microtubule-targeting agents, MTAs）已用于多种恶性肿瘤治疗，秋水仙碱（colchicine, COL）及相关化合物则靶向COL结合位点。然而，许多传统MTAs的临床疗效受到全身毒性和多药耐药（multidrug resistance, MDR）限制，因此需要具有更优治疗特征的新型微管靶向化合物。SB225002是一种小分子苯基脲化合物，最初由White等人在1998年开发为白细胞介素-8（interleukin-8, IL-8/CXCL8）受体CXCR2的强效非肽拮抗剂，用于抑制中性粒细胞趋化。近期研究显示其具有抗肿瘤活性，可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞周期阻滞和凋亡。更重要的是，SB225002可扰动微管动力学并诱导有丝分裂灾难，且不依赖其CXCR2拮抗作用；分子对接提示其可能结合β-tubulin的vinca结合区。与天然产物来源MTAs相比，SB225002结构简单、易于化学修饰，临床前模型中毒性较低、选择性较好，并在P-糖蛋白介导耐药、p53缺陷或突变细胞中保留细胞毒活性。尽管具有这些潜在优势，SB225002与微管蛋白相互作用的高分辨率结构数据仍缺乏，其结合的结构和动态基础尚不清楚。因此，研究人员旨在解析SB225002–微管蛋白复合物晶体结构，并基于该结构开展MD模拟，以定义SB225002–微管蛋白识别的分子基础及其对微管蛋白结构和动力学的影响。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员通过X射线晶体学获得SB225002–微管蛋白复合物结构，并结合MD模拟、MM/PBSA（Molecular Mechanics/Poisson–Boltzmann Surface Area，分子力学/泊松–玻尔兹曼表面积）和DCCM（dynamic cross-correlation matrices，动态交叉相关矩阵）分析，提出SB225002优先削弱侧向微管蛋白相互作用而非纵向相互作用的机制。该工作为理解SB225002的微管调节活性提供了结构框架。

主要关键技术方法：研究人员采用X射线晶体学解析SB225002–微管蛋白复合物结构，分辨率2.60 ?，样本为猪脑微管蛋白（porcine brain tubulin，来源于Cytoskeleton）组装T2R-TTL复合物；在上海同步辐射BL18U1收集数据，HKL2000处理，PHASER分子置换，COOT建模，phenix.refine精修，MolProbity评估。基于该结构和apo结构（PDB: 4IIJ）构建三亚基模型，缺失环Leu273–Gln280用MODELLER生成，进行三次独立250 ns MD模拟；SB225002参数经CGenFF/FFTK优化，采用CHARMM36力场和TIP3P水模型。用MM/PBSA估算结合自由能，DCCM分析残基运动，SASA（solvent-accessible surface area，溶剂可及表面积）计算接触面积。另基于cryo-EM（冷冻电镜）结构（PDB: 8OTZ）与药物结合结构（PDB: 24PT）构建3 × 3微管蛋白模型，进行三次150 ns MD模拟。

研究结果：

SB225002 binding at the COL and VLB sites of β-tubulin in the experimental structure：X射线衍射在2.60 ?分辨率下解析复合物结构，发现三个SB225002分子结合于β-tubulin。一个分子占据COL结合位点，与β-tubulin的Gln134、Asn165和Glu198形成氢键；另两个分子位于二聚体界面的VLB结合位点，与β-tubulin的Lys174、Val175、Ser176以及α-tubulin的Asn329、Lys336、Phe351形成氢键。与apo结构（PDB: 4IIJ）叠加显示，多数区域偏差低于0.5 ?，但COL位点附近T7 loop（Arg241–Asp249）显著变化，Gly246–Asn249的Cα位置偏差超过3.1 ?，Asn249最大约6.4 ?；Gln245和Asn247侧链重排，apo中Asn247侧链位置与结合配体重叠。与COL结合结构（PDB: 4O2B）和VLB结合结构（PDB: 1Z2B）比较，COL结合引起T7 loop明显构象变化，VLB结合还引起侧向表面区域偏差。该结果表明T7 loop重排是该区域配体结合的常见结构特征，但不同化合物的空间范围不同。

Drug-induced perturbations at the β-tubulin lateral interface revealed by MD simulations：三次独立250 ns MD模拟显示，β-tubulin亚基快速收敛，RMSD（root-mean-square deviation，根均方偏差）在初始25 ns内稳定低于3.0 ?，β-tubulin最大约2.5 ?，α-tubulin低于3.0 ?；三亚基质心角度平均为165°–167°，提示模拟中无显著纵向组装变化。平均结构与初始结构比较显示，结构化核心基本稳定，较大偏差主要在重建的Leu273–Gln280 loop和C端。模拟平均结构中T7 loop的apo与药物结合差异与晶体结构一致。RMSF（root-mean-square fluctuation，根均方涨落）分析中，位置425以后C端尾部超过10 ?并排除，其余低于5 ?；ΔRMSF > 0.7 ?的残基主要聚集在侧向界面相关表面。该结果表明药物优先改变β-tubulin侧向界面相关表面的柔性。

Drug-binding positions and MM/PBSA binding energetics across three MD simulations：COL位点配体在三次模拟中保持高度局部化，平均MM/PBSA结合自由能为?46.37 kcal/mol。VLB位点两个配体vlb1和vlb2位置变异较大，但均保持与微管蛋白结合，未观察到不可逆解离。第一次模拟中vlb1从初始位置移动但仍结合β-tubulin，其结合能达?33.52 kcal/mol，vlb2平均?30.76 kcal/mol；第二次模拟中vlb2向α-tubulin移动；第三次模拟中两者接近初始位置，个体能量波动但合并贡献较稳定。两个VLB位点配体均结合时，合并平均MM/PBSA结合能为?59.14 kcal/mol。该结果表明VLB位点配体构象移动性大于COL位点，但所有SB225002在模拟时间内保持结合。

Drug effects on longitudinal interactions between tubulin dimers：通过盐桥和氢键分析比较apo与药物结合体系。Salt bridge analysis between adjacent tubulin subunits：Lys103–Glu401、Lys174–Glu205和Asp295–Lys297盐桥出现率降低，分别从42.28%到34.57%、46.90%到22.35%、67.33%到47.44%；其中Lys174–Glu205位于纵向界面且相对降低最大。结构分析提示SB225002与Lys174和Val175持续氢键，改变Lys174局部环境，可能降低其与Glu205形成盐桥的可用性。另两个盐桥位于β-tubulin侧向界面相关表面。Hydrogen bond analysis at the longitudinal interface：A₁–B₁二聚体内界面氢键平均增加1.8个，A₂–B₁二聚体间界面氢键分布基本不变；MM/PBSA分析A₂–B₁界面也无实质变化。该结果表明SB225002引起纵向组装内部局部重排，但未显著改变相邻微管蛋白二聚体总体相互作用。Drug-induced changes in lateral interactions：由于晶体结构和微管模型仅含四个纵向排列亚基，无法直接分析侧向相互作用；研究人员通过将模拟中β-tubulin动力学与cryo-EM结构（PDB: 8OTZ）比较间接评估。apo微管中相邻β-tubulin氢键主要位于85–125、278–297和336区域。该部分提示需进一步评估侧向接触。

DCCM reveals altered dynamics associated with the lateral interface：DCCM分析显示，apo体系中黑框区域呈强负相关，提示明显反相关运动；药物结合后相关性转向零或弱正，原有反相关动态耦合明显减少。两个残基组对85–100/286–293和101–125/322–335在apo中反相关最强，映射到β-tubulin侧向界面相关表面，并与侧向界面氢键区域重叠。该结果表明SB225002优先扰动侧向界面相关分子内动力学，但三 FL? 亚基模型无侧向接触，不能直接评估其是否转化为侧向相互作用改变。

Comparison of lateral and longitudinal interactions in the 3 × 3 tubulin model：为直接评估侧向接触，研究人员构建3 × 3微管蛋白模型，以cryo-EM结构（PDB: 8OTZ）为参考，药物结合模型引入晶体结构（PDB: 24PT），每个体系进行三次150 ns MD模拟。用接触面积比较侧向和纵向相互作用。药物结合使纵向和侧向接触面积分布均向较小值移动；纵向众数从88.87降至70.37 nm²，减少约20%；侧向众数从31.12降至18.125 nm²，减少超过40%，侧向相对减少约为纵向两倍。时间平均接触面积同样显示纵向和侧向分别减少20.75%和24.84%，侧向仍受影响更强。该结果支持SB225002优先影响侧向微管蛋白相互作用。

讨论与结论：讨论部分总结认为，结构和模拟分析支持SB225002优先扰动侧向而非纵向微管蛋白相互作用的机制。基于晶体结构的模型提供了识别药物诱导局部变化的直接实验基础，显示纵向相互作用总体影响有限，而结构柔性和分子内动态耦合优先在β-tubulin侧向界面相关表面改变。3 × 3模型进一步直接评估侧向和纵向接触，独立支持相同趋势。该模型仍为天然微管晶格近似，并整合不同实验结构，因此其定量结果应主要解释为对SB225002相对影响的半定量支持，而非生理变化的精确估计。尽管如此，两种建模方法一致，增强了侧向微管蛋白相互作用优先削弱是SB225002作用机制重要组分的结论。研究结论部分可概括翻译为：结构和模拟分析支持SB225002优先扰动侧向而非纵向微管蛋白相互作用的机制；基于晶体结构的模型为识别药物诱导的局部变化提供直接实验依据，并显示纵向相互作用总体影响相对有限，而结构灵活性和分子内动态耦合在β-tubulin侧向界面相关表面优先改变；更大的3 × 3模型使侧向和纵向接触得以直接评估，独立支持相同趋势；该模型仍是天然微管晶格的近似，并整合不同实验结构，因此定量结果主要应解释为半定量支持而非生理变化的精确估计；尽管存在这些局限，两种建模方法之间的一致性增强了如下结论：侧向微管蛋白相互作用的优先削弱是SB225002作用机制的重要组成部分。