天然天冬氨酰-tRNA合成酶片段DARS-N1靶向LTBP-1选择性诱导肌成纤维细胞凋亡以消解组织纤维化

《Journal of Biological Chemistry》：Natural Asp-tRNA Synthetase Fragment Targets Myofibroblasts to Abrogate Tissue Fibrosis

　　

纤维化（fibrosis）仍然是一个重大的全球健康挑战，现有疗法有限且仅能减缓疾病进展。虽然已知氨基酸-tRNA合成酶（aaRS）家族利用进化上附加的结构域作为细胞外信号分子，但其在调控纤维化过程稳态中的作用尚不明确。研究人员鉴定出一种天然蛋白水解片段——天冬氨酰-tRNA合成酶（DARS）片段，称为DARS-N1，其通过靶向细胞外基质（ECM）上的潜伏转化生长因子β结合蛋白1（LTBP-1），选择性触发肌成纤维细胞凋亡。这一具有活性的DARS N端片段降低未分化成纤维细胞和肌成纤维细胞中黏着斑激酶（FAK）的活化，而仅肌成纤维细胞表现出细胞-基质附着不足，导致锚定依赖性存活丧失并促进凋亡。研究人员利用ATYR0101——一种为延长血清暴露而工程化改造的DARS-N1治疗形式，在肺（bleomycin，博来霉素）模型中证明其抗纤维化活性。空间转录组学分析显示，ATYR0101激活促进恢复健康状态的修复程序。这些发现突出ATYR0101作为破坏慢性组织纤维化过程的变革性疗法的潜力。

该研究围绕慢性组织纤维化（fibrosis）的治疗难题展开。组织损伤可由遗传、环境或炎症刺激触发，导致肺、肝、肾、心、皮肤等多器官纤维化。常见纤维化相关疾病包括间质性肺病、特发性肺纤维化（IPF）、囊性纤维化、病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、慢性肾病、心力衰竭和硬皮病等，其平均年发病率约为5,000/100,000人年，造成全球高疾病负担和死亡率。美国约45%的死亡可归因于严重纤维化疾病。纤维化的核心特征是细胞外基质（ECM）过度沉积，扭曲组织结构并导致器官衰竭。成纤维细胞（fibroblast）活化为肌成纤维细胞（myofibroblast）在其中居于中心地位，后者合成和重塑ECM，促进胶原沉积和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达，增强收缩活性。生理性修复是短暂的，而病理性纤维化由肌成纤维细胞逃避凋亡并持续存在所驱动。TGF-β等生化信号和基质硬度等机械因素强化肌成纤维细胞持续活化，形成自我维持的纤维化反馈环。因此，靶向肌成纤维细胞命运、触发其凋亡，是解决已建立纤维化疾病的有希望策略。同时，aaRS家族除经典蛋白合成功能外，还具有细胞外和非经典功能，可调控血管生成、免疫炎症信号、转录、肿瘤发生和神经功能等。这些新功能与高等真核生物特有的附加非催化结构域有关，这些结构域可通过可变剪接和蛋白酶切释放，并经非常规分泌途径进入细胞外空间，由组织或病理特异性蛋白酶激活。基于此，研究人员利用蛋白质组学质谱表征炎症条件下aaRS相关非经典蛋白，定义其细胞外靶点、下游功能及治疗潜力，最终发现DARS-N1/LTBP-1轴，并开发ATYR0101，证明其可选择性清除病理性肌成纤维细胞并在动物模型中减轻纤维化。

关键技术方法方面，研究人员采用液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）分析LPS活化的THP-1人巨噬细胞分泌蛋白组，并在小鼠鼻内LPS模型中检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中DARS片段；用重组DARS体外蛋白酶切验证DARS-N1释放。通过TriCEPS配体-受体捕获联合质谱鉴定LTBP-1，并以AlphaLISA及竞争实验验证结合、结合域和跨物种特异性。构建DARS-N1-Fc融合蛋白ATYR0101，在细胞模型中采用活细胞成像、caspase-3/7、annexin V、JC-1、FAK磷酸化ELISA、免疫印迹和免疫荧光，以及RNA测序和基因集富集分析（GSEA）。体内使用博来霉素（bleomycin）肺纤维化模型和单侧输尿管梗阻（UUO）肾纤维化模型，并进行空间转录组学。样本来源包括人IPF患者原代肺成纤维细胞、正常供体原代肺成纤维细胞，以及WI-38、MRC-5、A549、THP-1等细胞系和C57BL/6雄性小鼠等。

研究结果如下。

Natural proteolytic DARS fragment is liberated under inflammatory conditions and binds LTBP-1（炎症条件下释放天然蛋白水解DARS片段并结合LTBP-1）：通过LC/MS/MS分析LPS活化的THP-1巨噬细胞分泌蛋白组，研究人员检测到胞质DARS的N端片段DARS-N1，涵盖人残基1-154，且仅在LPS刺激后的细胞外空间出现。免疫印迹证实约20 kDa片段为DARS-N1，质谱也检测到培养基中全长DARS，提示DARS-N1来源于细胞外全长DARS的蛋白酶切。重组人DARS经PMN弹性蛋白酶切割于Leu¹⁵⁴后可释放DARS-N1，MMP-12也可产生一致片段。小鼠鼻内LPS后，BALF中细胞外全长DARS显著增加，并伴随与DARS-N1大小一致的片段；乳酸脱氢酶（LDH）未显著积累，说明并非单纯细胞破裂。通过TriCEPS靶点鉴定，LTBP-1被确定为DARS-N1结合伴侣。免疫荧光显示DARS-N1结合TGF-β刺激的WI-38细胞沉积ECM，并与LTBP-1共定位；LTBP-1 siRNA敲低后结合消失。该部分结论是：炎症条件下天然DARS-N1被释放并直接结合LTBP-1。

Engineering of ATYR0101, a stable therapeutic DARS-N1-Fc fusion that selectively binds LTBP-1（工程化稳定治疗性DARS-N1-Fc融合蛋白ATYR0101并选择性结合LTBP-1）：由于DARS-N1血清半衰期较短，研究人员构建ATYR0101，将DARS-N1残基3-154与人IgG4 Fc融合，并引入S228P和L235E突变以降低Fc效应功能，同时引入R81C、N86C和C130S突变以提高稳定性。ATYR0101在Expi293F细胞中表达并经Protein A纯化，确认形成二聚体，较亲本DARS-N1具有改善的血清暴露和分子均一性。AlphaLISA显示ATYR0101与LTBP-1直接结合，半数有效浓度（EC₅₀）为26 nM；外源ATYR0101、抗DARS抗体和抗LTBP-1抗体可竞争性抑制结合，半数抑制浓度（IC₅₀）分别为30.6 nM、71.4 nM和23.4 nM。片段结合实验显示ATYR0101结合LTBP-1短形式及L1S_1006-1395、L1S_1186-1395片段，提示其靶向LTBP-1 C端区域；并在人、小鼠、大鼠和食蟹猴LTBP-1中显示相似结合。该部分结论是：ATYR0101是稳定且选择性结合LTBP-1的治疗性分子。

ATYR0101 induces selective apoptosis in myofibroblasts while sparing undifferentiated fibroblasts（ATYR0101选择性诱导肌成纤维细胞凋亡而不影响未分化成纤维细胞）：研究人员用ATYR0101处理WI-38人肺成纤维细胞或TGF-β诱导分化的WI-38肌成纤维细胞。未分化成纤维细胞在细胞形态和总汇合度上无可见变化；而TGF-β分化肌成纤维细胞出现细胞骤然皱缩、聚集和最终丢失等凋亡形态，caspase-3/7水平升高，诱导凋亡的EC₅₀为190 nM。ATYR0101在多种肺成纤维细胞系、IPF患者原代肺成纤维细胞和健康供体原代肺成纤维细胞中，均对TGF-β分化肌成纤维细胞表现选择性凋亡诱导，而对未分化成纤维细胞无明显作用；对A549肺上皮细胞及TGF-β诱导的上皮-间质转化影响可忽略。ATYR0101处理的TGF-β分化WI-38肌成纤维细胞早期附着减少，FAK Tyr³⁹⁷磷酸化呈剂量依赖性降低，免疫荧光显示总FAK胞质弥散，磷酸化FAK减少且与黏着斑共定位降低。JC-1染色显示线粒体去极化增加。该部分结论是：ATYR0101通过降低FAK活化、诱导线粒体去极化并激活caspase-3/7，选择性诱导TGF-β分化肺肌成纤维细胞凋亡。

ATYR0101 induced myofibroblast apoptosis is dependent on LTBP-1 and active TGF-β signaling（ATYR0101诱导的肌成纤维细胞凋亡依赖LTBP-1和活性TGF-β信号）：重组LTBP-1共处理可完全阻断ATYR0101诱导的肌成纤维细胞凋亡表型和annexin V信号。TGF-β受体抑制剂SB-431542或SB-525334处理可导致IPF患者来源原代肌成纤维细胞及WI-38肌成纤维细胞中ATYR0101诱导的凋亡表型完全丧失，annexin V信号受抑。全基因组RNA测序显示，ATYR0101处理的WI-38肌成纤维细胞转录谱明显区别于对照蛋白或TGF-β缓冲液处理细胞。对50条 hallmark 通路的GSEA显示，ATYR0101显著下调多条TGF-β激活通路，包括上皮-间质转化、糖酵解、MYC和mTOR信号。该部分结论是：ATYR0101诱导的肌成纤维细胞凋亡依赖LTBP-1相互作用和活性TGF-β信号，并伴随下游基因表达改变。

ATYR0101 exhibits anti-fibrotic activity in animal models of fibrosis（ATYR0101在动物纤维化模型中显示抗纤维化活性）：研究人员发现LTBP-1在健康小鼠肺实质中可检测，在博来霉素处理小鼠肺中总体略增并在纤维化灶明显表达。药代分析显示腹腔注射后24小时ATYR0101存在于循环，并可在BALF中检测，且与纤维化小鼠肺组织中的LTBP-1共定位。在博来霉素肺纤维化模型中，ATYR0101处理显著降低胶原含量和Ashcroft评分；nintedanib在降低胶原含量方面更有效，而ATYR0101显著降低Ashcroft评分，并减少α-SMA阳性细胞频率，提示肌成纤维细胞减少。在UUO肾纤维化模型中，UUO小鼠肾脏LTBP-1表达增加，ATYR0101处理降低肾脏重量、皮质胶原含量并经病理评估显著减轻纤维化。该部分结论是：ATYR0101在肺和肾纤维化模型中均显示抗纤维化活性。

Spatial transcriptomics reveals ATYR0101 reduces fibrosis by activation of restorative pathways（空间转录组学揭示ATYR0101通过激活修复通路减轻纤维化）：研究人员对博来霉素肺纤维化模型样本进行空间转录组学分析，降维聚类鉴定出18个独特细胞群，并用单细胞RNA测序参考数据集进行细胞类型反卷积命名。分析定义出七种表型，显示ATYR0101与nintedanib处理的细胞群不同。ATYR0101处理肺中富集的细胞群更接近未处理na?ve肺，而nintedanib处理肺仍具有较高炎症相关通路活性。ATYR0101特异性表型以上调血管生成相关基因、尤其VEGF信号为特征。由于ATYR0101处理肺细胞群与na?ve肺高度相似，研究人员认为靶向LTBP-1可能促进肺恢复健康状态。该部分结论是：ATYR0101通过不同于nintedanib的机制，激活修复性程序并促进肺向健康状态转变。

讨论部分指出，现有抗纤维化疗法如nintedanib和pirfenidone主要通过抑制TGF-β信号和减缓ECM沉积来延缓疾病进展，但缺乏逆转已建立纤维化的能力，可能因其未解决活化肌成纤维细胞的持续存在。DARS-N1/LTBP-1轴的发现引入了一种机制上不同的范式：选择性诱导肌成纤维细胞凋亡，以促进稳态调控并打断纤维化循环。与广谱细胞毒性凋亡抑制剂不同，ATYR0101利用肌成纤维细胞-基质相互作用的特定脆弱性，通过靶向ECM中的LTBP-1破坏锚定依赖性存活，清除驱动自持续纤维化循环的细胞，同时保留健康上皮细胞和未分化成纤维细胞群体。体内研究显示，ATYR0101在多种纤维化模型中打断纤维化循环，并在博来霉素肺纤维化模型残余纤维化灶中减少α-SMA⁺肌成纤维细胞。空间转录组学显示，ATYR0101介导的纤维化减轻由独特分子程序驱动，促进向修复性细胞环境转变，其转录组谱接近na?ve肺，提示其不仅阻断疾病进展，还可能促进纤维化病理向稳态结构逆转。该再生效应被归因于双重作用：靶向清除肌成纤维细胞，同时富集VEGF相关血管生成通路。与多激酶抑制剂通过VEGFR阻断抑制血管重塑相反，ATYR0101促进有利于健康再血管化的环境。IL-2信号富集提示其可能通过调节性T细胞（Tregs）促进免疫介导的稳态。此外，ATYR0101显著下调TGF-β驱动的上皮-间质转化、糖酵解、MYC和mTOR等通路。研究局限包括：虽然确立LTBP-1为ATYR0101介导肌成纤维细胞凋亡所必需的细胞外锚点，但机械感觉信号复合物的精确分子组成尚未完全阐明；LTBP-1、整合素和细胞骨架相互作用具有动态性，需高分辨率结构和生物物理研究；体内因凋亡细胞清除动力学迅速，难以直接捕获凋亡事件，无法建立ATYR0101结合LTBP-1与α-SMA⁺肌成纤维细胞减少之间的时间性因果联系，未来需利用活体多光子显微镜和基于FRET的caspase传感器进行研究。研究结论部分翻译如下：总体而言，研究人员的数据表明，ATYR0101作为一种具有独特作用机制的新型抗纤维化治疗候选物具有显著潜力，并可能将纤维化治疗从稳定化转向修复。通过调控一条进化上保守的生理通路，该治疗策略可能提供一种高度选择性的策略，以消除致病性肌成纤维细胞、打断慢性纤维化循环并促进正常组织结构恢复。