可溶性环氧化物水解酶（sEH）N端磷酸酶（N-phos）催化anandamide phosphate生成anandamide并抑制血管内皮细胞（VEC）活化

《Journal of Biological Chemistry》：N-terminal phosphatase of soluble epoxide hydrolase forms anandamide from anandamide phosphate

　　

可溶性环氧化物水解酶（sEH）表现出两种不同活性：C端环氧化物水解酶（C-EH）和N端磷酸酶（N-phos）。环氧脂肪酸是C-EH的主要底物，并具有抗炎特性。N-phos水解脂质磷酸单酯，如类异戊二烯焦磷酸、溶血磷脂酸（LPA）和1-磷酸鞘氨醇（S1P）。研究人员发现，抑制两种sEH活性而非仅抑制C-EH，可抑制血管内皮细胞（VEC）活化。来自小鼠肝提取物的带负电荷极性脂质（NCPL）组分也抑制VEC活化。该效应可被sEH处理取消。抑制类异戊二烯和一氧化氮合成，以及用环氧二十碳三烯酸（EET）、LPAs和典型S1P处理，均不抑制VEC活化，提示除这些代谢物外的某一代谢物负责抑制VEC活化。为鉴定负责该活性的sEH底物，研究人员使用NCPL进行了非靶向LC-MS/MS分析。结果，磷酸-N-酰基乙醇胺（p-NAE）作为候选物出现。酶动力学分析证实，该类物质包括花生四烯酰乙醇酰胺（anandamide）磷酸，是良好的N-phos底物。外源加入anandamide phosphate在3 μM或以上浓度抑制VEC活化相关的细胞黏附分子表达。

可溶性环氧化物水解酶（sEH）是一种双功能酶，具有C端环氧化物水解酶（C-EH）和N端磷酸酶（N-phos）两种活性。C-EH的底物包括环氧二十碳三烯酸（EET）等抗炎环氧脂肪酸，参与多种生理过程；N-phos可水解法尼基焦磷酸、溶血磷脂酸（LPA）、1-磷酸鞘氨醇（S1P）等脂质磷酸。近期利用抑制剂和基因编辑动物研究提示，N-phos抑制可调节血管内皮细胞（VEC）一氧化氮信号、血管内皮生长因子表达、类异戊二烯合成和胆固醇转运，选择性缺失N-phos的动物出现能量/脂肪代谢和认知功能改变。然而，介导这些作用的分子尚未明确。研究人员先前发现N-phos抑制可能通过细胞内钙离子稳态影响巨噬细胞功能，并在糖尿病条件下影响小鼠肝纤维化。本研究旨在寻找N-phos抑制抑制VEC活化的因子，并鉴定新的N-phos底物。

研究显示，sEH双活性抑制而非仅C-EH抑制可抑制VEC活化；小鼠肝提取物中带负电荷极性脂质（NCPL）也抑制VEC活化且经sEH处理失活；非靶向LC-MS/MS将磷酸-N-酰基乙醇胺（p-NAE）鉴定为候选底物；p-NAE尤其p-AEA是N-phos良好变构底物，N-phos可去磷酸化p-NAE生成N-酰基乙醇胺（NAE），包括anandamide（AEA）；外源p-NAE可抑制VEC活化。该研究为NAE生物合成非经典途径提供了sEH参与的证据，并揭示sEH N-phos在VEC活化调控中的作用。

为开展研究，研究人员采用HMVEC与U937细胞黏附实验及RT-qPCR检测黏附分子表达；用AttoPhos和PHOME测N-phos与C-EH活性；从ICR小鼠肝（Sankyo Labo Service）提取NCPL，经DEAE-纤维素分离、sEH处理、DNS-Cl/DNS(d₆)-Cl差异标记，用靶向/非靶向LC-MS/MS（Waters Xevo TQD、LTQ-Orbitrap、Sciex TripleTOF 6600+）鉴定底物；用Hill方程分析p-OEA、p-LEA、p-AEA动力学；用LC-MS/MS测定C57BL/6NCrslc小鼠、sEH缺陷B6.129X-Ephx2^tm1Gonz/J小鼠（Jackson Laboratory）脑及RAW264.7细胞（东北大学）中p-NAE/NAE。

结果部分。sEH抑制抑制VEC活化：HMVEC经N-phos/C-EH双抑制剂SMTP-7处理后，脂多糖（LPS）诱导的U937细胞结合显著降低，洗涤后仍有效；N-phos相对选择性抑制剂ebselen和Boc-Tyr(Cl₂-Bzl)也抑制，而C-EH特异性抑制剂AUDA不抑制。一氧化氮合成抑制剂N^G-nitro-L-arginine methyl ester（L-NAME）或1400W、类异戊二烯合成抑制剂普伐他汀均不影响LPS诱导或SMTP-7效应，提示N-phos抑制通过非一氧化氮、非类异戊二烯途径抑制VEC活化。

N-phos底物可能介导VECs细胞黏附分子表达抑制：SMTP-7降低ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达，其他sEH抑制剂类似；AUDA无效，C-EH底物14,15-EET不抑制E-selectin。小鼠肝NCPL抑制细胞黏附分子表达，且其活性经sEH处理削弱。LPA和S1P处理不影响，提示未知N-phos底物介导。

差异标记靶向LC-MS/MS验证：NCPL经sEH处理与未处理分别用DNS-Cl和DNS(d₆)-Cl标记，靶向分析LPA和S1P。潜在sEH产物表现为相差6个质量单位、强度不同的离子对；鉴定单酰甘油和sphingosine(d18:1)为潜在N-phos产物。LTQ-Orbitrap数据独立非靶向分析确认该方法，并发现非典型sphingosine(d16:1)和sphingosine(d20:1)。

非靶向LC-MS/MS鉴定LEA：Sciex TripleTOF 6600+分析中，MS/MS非氘产物离子m/z 170.0964 [C₁₂H₁₂N]⁺强度显著高于氘代离子m/z 176.1341 [C₁₂H₆D₆N]⁺，碎片模式与亚油酰乙醇酰胺（LEA）一致，提示LEA为N-phos产物。

p-NAEs是N-phos变构底物：酶动力学分析p-OEA、p-LEA、p-AEA。三者均为活性变构底物，Hill系数1.5至4.1。p-AEA最有利，k_cat/K_m为0.42 min^?1 μM^?1，与arachidonoyl-LPA的0.53 min^?1 μM^?1相当；p-LEA和p-OEA分别为0.25和0.077 min^?1 μM^?1。提示sEH参与NAE生物合成。

外源p-NAE对VEC活化的影响：p-OEA和p-LEA在30 μM显著抑制LPS诱导E-selectin；p-AEA在10和30 μM分别抑制33%和46%（P<0.001）。p-LEA对ICAM-1更明显，3 μM显著，30 μM抑制68%。说明p-NAE可抑制VEC活化。

小鼠脑和RAW264.7细胞中p-NAE/NAE水平：LC-MS/MS测定显示野生型小鼠脑p-OEA/OEA为11.3±0.5和59.0±6.4 pmol/g，相当于14.1±0.6和73.8±8.0 nM。SMTP-7轻度增加p-OEA/OEA比，但无统计显著；sEH缺陷小鼠p-OEA和OEA与野生型类似。RAW264.7细胞内源p-OEA、OEA、LEA、p-AEA、AEA低于检测限，p-LEA可检测为0.48±0.38 fmol/10⁷细胞，相当于9.7±7.5 nM。外源30 μM p-LEA 15 min使细胞p-LEA升至1.6±1.2 fmol/10⁷细胞（33±24 nM）；SMTP-7和F^?/VO₄^3?分别增加约12和3.7倍。提示sEH调节RAW264.7细胞p-LEA水平。

讨论部分总结：讨论提出五点：(i) sEH抑制导致VEC活化抑制；(ii) N-phos底物可能参与；(iii) 非靶向探索鉴定NAE种类为候选N-phos底物；(iv) N-phos去磷酸化p-NAE形成NAE如anandamide；(v) p-NAE尤其p-AEA处理VECs抑制VEC活化。N-phos/C-EH双抑制剂抑制VEC活化，而C-EH抑制剂无作用，提示N-phos抑制参与。尽管N-phos抑制与一氧化氮形成和类异戊二烯合成调控相关，但抑制这些通路不影响VEC活化；EET无影响；NCPL活性可被sEH处理取消，支持N-phos底物介导。差异标记法经LPA和S1P验证，非靶向分析鉴定NAE候选。NAE是生物活性脂肪酸乙醇酰胺家族，p-NAE是NAE生物合成四途径之一中间体；已知PTPN22和SHIP1可转换p-NAE至NAE，本研究提示sEH为额外贡献者。脑内OEA水平与文献相当，但p-OEA无文献可比；sEH抑制未显著增加p-NAE/NAE比，可能因脑内其他转化途径或代偿机制。RAW264.7中SMTP-7增加p-LEA，而sEH对氟化物和钒酸盐不敏感，PTPN22对钒酸盐高度敏感，提示差异。p-NAE抑制VEC活化所需浓度较高，且HMVEC内源p-NAE低于检测限，无法明确细胞内p-NAE作用，是研究限制；p-NAE抑制VEC活化机制未涉及。研究结论翻译：本研究揭示以下五点：(i) sEH抑制导致VEC活化抑制；(ii) N-phos底物可能在该效应中发挥作用；(iii) 非靶向探索鉴定一种NAE为候选N-phos底物；(iv) N-phos去磷酸化p-NAEs以形成NAEs，如anandamide；(v) 用p-NAEs尤其p-AEA处理VECs导致VEC活化抑制。