## 中文标题 RNA工程化策略助力中大型RNA的高分辨率结构解析

《Journal of Biological Chemistry》：RNA engineering approaches to aid high-resolution structure determination of medium- to large-sized RNAs

　　

## 摘要专业翻译

RNA的高分辨率结构测定因其构象灵活性、固有异质性和易降解性而面临重大挑战。尽管RNA在基因调控、病毒复制和细胞稳态中发挥核心作用，但仅含RNA的结构在蛋白质数据银行（Protein Data Bank, PDB）中的占比仍然很小。因此，克服与RNA相关的局限性，需要开发创新的工程化策略，以稳定特定构象并促进结构分析。本综述描述了研究人员通过X射线晶体学（X-ray crystallography）和冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）实现中大型RNA结构测定所采用的RNA工程化方法。这些进展包括利用稳定的四环发夹（tetraloop）促进正确折叠和晶体堆积；基于tRNA和5S rRNA支架的重组RNA生产和稳定化策略；以及利用噬菌体Φ29前头RNA（prohead RNA, pRNA）和Group I及Group II内含子支架促进cryo-EM结构测定。综上所述，这些方法将天然RNA结构特征和宿主加工机制转化为用于RNA稳定化、规模化生产和结构表征的实用工具。

## 论文解读文章

### 研究背景与问题

RNA分子除作为蛋白质合成的线性模板外，还能折叠成特定的三级结构，从而决定其稳定性、细胞内定位以及与蛋白质、其他RNA和小分子配体的相互作用。经典的依赖于结构的RNA包括转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA），其高度保守的折叠结构对准确翻译和核糖体功能至关重要。细胞信使RNA（mRNA）中亦含有功能性结构元件，如铁蛋白和转铁蛋白受体mRNA中的铁反应元件，以及应激响应mRNA中的内部核糖体进入位点。病毒RNA同样依赖复杂的高级结构来控制复制、翻译和宿主互作。RNA结构的破坏与多种疾病相关，包括病毒感染和遗传疾病，因此解析RNA的天然折叠结构具有重要意义。

然而，RNA的结构测定仍面临显著瓶颈。PDB中已有超过20万个结构，但仅约3%（8,150个）包含RNA，而纯RNA结构不足1%（1,890个）。RNA的高度动态构象源于其高度带电的磷酸-糖骨架、核糖2′羟基的化学活泼性，以及能够容纳多种堆积和折叠相互作用的能力。RNA结构的固有异质性来自其能在多个低能构象状态下采样，结构灵活性常由瞬态和弱的长程相互作用驱动。这些特性使得核磁共振波谱、X射线晶体学和冷冻电镜等标准技术在中大型RNA的结构解析中面临独特挑战。NMR对于探测小型RNA和寡核苷酸的构象动态十分有效，但对超过50个核苷酸（nt）的中大型RNA则受限于谱峰重叠；而X射线晶体学和cryo-EM虽更适合中大型RNA，但RNA的构象异质性和灵活性常限制分辨率和数据质量。为此，近年来出现了多种创新策略以稳定RNA构象并实现高分辨率结构分析。

### 研究人员开展的研究内容与意义

本综述系统总结了多种RNA工程化策略，这些策略重新利用天然RNA的结构特征和宿主加工机制，将其转化为RNA稳定化、规模化生产和结构表征的实用工具。具体包括：利用四环发夹（tetraloop）和五环发夹（pentaloop）序列稳定RNA茎环结构；利用tRNA支架和5S rRNA支架实现目标RNA在大肠杆菌中的重组表达和稳定化；利用噬菌体Φ29 pRNA支架介导RNA五聚体组装以适配cryo-EM结构测定；以及利用Group I和Group II内含子作为大型刚性支架促进cryo-EM高分辨率结构解析。这些方法分别针对RNA结构测定中的不同瓶颈，为不同尺寸、不同结构复杂度的RNA提供了多样化的解决方案，有力推动了RNA结构生物学领域的发展。

### 主要技术方法概述

本综述涵盖的技术方法主要包括以下几类：基于四环发夹（如GNRA、UNCG、CUYG家族）的RNA茎环末端稳定化和晶体接触工程策略，通过引入天然存在的loop-受体相互作用促进晶体堆积；基于tRNA支架的重组RNA生产方法，将目标RNA插入tRNA反密码子臂并在大肠杆菌中通过lpp启动子和rrnC终止子驱动转录表达，经阴离子交换层析纯化获得高产量嵌合RNA；基于5S rRNA支架的方法（来源于Vibrio proteolyticus），通过删除螺旋区III阻止核糖体组装并将loop B改造为BstEII酶切位点以实现目标RNA插入；基于Φ29噬菌体pRNA及其环状置换变体（pRNAcp）的pARIS技术，利用pRNA五聚体在噬菌体前头（prohead）上的组装实现目标RNA的对称化展示和cryo-EM分析；以及基于Group I内含子（四膜虫核酶）环状置换和Group IIC内含子（Oceanobacillus iheyensis）Domain III插入的支架策略。需指出，pRNA和内含子支架系统采用体外转录方式制备，而tRNA和5S rRNA支架利用大肠杆菌重组表达。各方法均需通过凝胶迁移实验或配体结合实验验证嵌合RNA的功能完整性。

### 研究结果

#### 1. 四环发夹对RNA茎环的稳定作用

16S rRNA含有31个发夹环结构，其中17个为四环发夹，分属GNRA、UNCG和CUYG三种主要类别。GNRA和UNCG四环分别通过非经典碱基对（如G1•A4、U1•G4摆动配对）和碱基堆积形成独特且稳定的三维几何构象，而CUYG四环因Y3的变构行为柔性稍大。部分五环序列（如GNRNA和CUYG(N)五环）也可采用类似四环的折叠几何。在应用方面，研究人员通过将4.5S RNA的GNRA四环由GGAA优化为GAAA，成功获得SRP核糖核蛋白复合物的晶体结构（PDB: 1DUL），四环通过与相邻双链螺旋的小沟相互作用介导晶体接触，而未改变RNA天然结构及蛋白互作方式。另一典型案例是将GAAA四环与其天然受体（TR）基序分别插入丁型肝炎病毒（HDV）核酶的非必需茎区，介导分子间晶体接触，成功获得晶体。

#### 2. tRNA支架的应用

研究人员将登革病毒和寨卡病毒的茎环A（SLA，约70 nt）插入tRNA^Lys支架的反密码子环中，在E. coli中重组表达并纯化。晶体结构显示，SLA实际采用的三维折叠与二级结构预测存在偏差：预测的侧茎环在结构中呈现单链构象并参与分子间相互作用，且该侧环区域起到铰链作用以调节顶茎和底茎之间的角度。tRNA部分直接在晶体接触中发挥作用。此外，基于SLA-tRNA嵌合体的突变和生化研究表明SLA通过顶部茎环的顶环区域与NS5蛋白结合，该结论后经无tRNA支架的登革病毒NS5-SLA复合物cryo-EM结构（PDB: 8GZP）证实。值得注意的是，初始寨卡病毒SLA晶体衍射质量不佳，通过在tRNA-SLA接头区域引入一个碱基对使茎旋转约36°，促进了替代性晶体堆积并改善了衍射质量。

#### 3. 5S rRNA支架的应用

5S rRNA支架（约120 nt）采用Vibrio proteolyticus来源的突变体，通过删除β结构域中的螺旋区III阻止核糖体组装，使嵌合RNA以游离形式积累于细胞质中。孔雀石绿结合RNA适配体（39 nt）融合至5S rRNA支架后，其解离常数（Kd = 1.0 μM）与游离适配体（Kd = 0.9 μM）基本一致，表明支架不干扰配体结合功能。研究人员利用此支架成功表达了HIV-1 Rev反应元件（RRE）和5′ UTR区域（分别为162 nt和194 nt），5S rRNA融合的RRE保留了与HIV-1 Rev蛋白的结合能力，亲和力与未修饰RRE相当，且可获得晶体。5S rRNA支架的5′ UTR嵌合RNA也通过cryo-EM实现了可视化。

#### 4. pRNA支架介导的五聚体RNA组装

Φ29 pRNA的71 nt最小功能片段保留了组装为五聚体环所需的全部结构元件。在pRNAcp支架设计中，天然5′和3′末端以UAAA四环连接，并在C茎区引入新末端，为目标RNA提供了结构受限的融合位点。利用此pARIS策略，研究人员将tRNA融合至pRNAcp的A区，通过cryo-EM数据处理中的对称扩展和计算扣除，先获得5.3 ?的pRNA-tRNA重建图，随后针对tRNA区域进行聚焦细化，获得4.8 ?的重建结构，其中tRNA的经典折叠结构清晰可辨，与已有晶体结构高度吻合。该方法通过增加有效分子质量、限定组装几何以及实现对称扩展，使单个小尺寸RNA的cryo-EM结构测定成为可能。

#### 5. Group I和Group II内含子支架

研究人员对四膜虫Group I内含子核酶进行环状置换，将天然5′和3′末端连接并在P6茎中引入新末端，再将目标RNA茎环融合至新末端。采用该策略，寨卡病毒和Tamana bat病毒xrRNA（23 kDa和17 kDa）以及氟化物核糖开关（17 kDa）的cryo-EM结构分别以4.5-5.0 ?的分辨率获得。Group IIC内含子支架则将目标RNA插入Domain III这一暴露于溶剂的外周茎环中，并采用催化失活突变体防止支架或目标RNA被剪切。利用该策略，86 nt的硫胺素焦磷酸（TPP）核糖开关和210 nt的raiA细菌非编码RNA分别以3.1 ?和3.0 ?的分辨率获得结构。Group II内含子支架的目标RNA融合位点位于内部茎环，相比末端融合提供更刚性的结构耦合，且该支架可有效消除小RNA在cryo-EM中常见的优势颗粒取向。

### 总结讨论与结论

本综述强调，选择RNA支架应综合考虑结构测定方法、工程灵活性、目标RNA大小和复杂度以及生产便捷性。X射线晶体学需要大量高浓度、高均一性的RNA，tRNA和5S rRNA支架因其可在大肠杆菌中实现重组规模化生产而具有优势，且其良好折叠的结构元件有助于晶体接触形成。cryo-EM所需样品量较少，但需要支架能增加目标RNA的有效尺寸并提供稳定的颗粒识别和比对特征，pARIS和内含子支架在此方面尤为适用。支架与目标RNA之间的连接刚度是影响目标分辨率的关键因素，将目标RNA嵌入结构受限的内部区域可提供比末端融合更刚性的耦合，这一原则在环状置换pRNA和Group II内含子支架中得到体现。值得注意的是，支架化目标RNA的分辨率强烈依赖于目标RNA自身的尺寸和固有结构刚性；较大且具有紧凑构象的RNA更易获得高分辨率结构，而较小或柔性较大的RNA即使附着于良好有序的支架仍然难以解析。

当前天然来源的RNA支架普遍存在一个共同架构限制：插入的RNA通常以双链末端配对的茎环形式呈现。该策略虽有利于结构稳定和有效折叠，但限制了对需要游离末端或长程分子内相互作用的RNA的整合。未来的支架设计有望获得更大的结构灵活性，以实现对多样RNA折叠类型的展示。随着RNA结构生物学、AI引导的RNA结构预测和RNA治疗学的交叉融合，下一代RNA支架将可能演化为可编程平台，能够控制RNA折叠、分子识别和生物学功能，从而拓展人类解析RNA生物学的能力，并在结构生物学、治疗学和合成生物学中产生新的应用。研究人员指出，本综述讨论的RNA支架并未涵盖所有可能性，新型支架的开发仍是活跃的研究方向，如基于劳斯肉瘤病毒移码元件的对称RNA二聚体和通过互补kissing-loop相互作用自组装形成的同源寡聚RNA环，均已在3-5 ?分辨率下实现了约70-400 nt RNA靶标的结构测定。