内源性维甲酸反应元件增强子通过调控Cyp26a1介导的维甲酸清除以控制胚胎干细胞分化

《Journal of Biological Chemistry》：An endogenous retinoic acid response element enhancer controls Cyp26a1-mediated retinoic acid clearance during embryonic stem cell differentiation

　　

维甲酸（retinoic acid，RA）信号的精确调控对于胚胎发育至关重要，因为RA可用性的波动可能扰乱细胞命运决定，并导致严重的发育异常。然而，在多能细胞分化过程中，诱导性RA清除如何在内源性染色质中被编码，目前仍知之甚少。本研究利用RA诱导的小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）分化体系，研究人员鉴定出Cyp26a1是该命运转变过程中诱导最强烈的基因之一。在参与RA合成与代谢的基因中，Cyp26a1以形成高度RA响应的远端增强子而独具特征。该增强子含有功能性RA反应元件（retinoic acid response elements，RAREs），并通过配体依赖性RAR/RXR结合、p300募集和H3K27ac沉积而被激活，同时伴随增强子-启动子相互作用的增强。遗传性删除该增强子或其核心RARE基序可显著损害Cyp26a1的诱导，证明该顺式调控模块对于完整的RA响应性转录激活是必需的。单细胞转录组分析进一步表明，破坏增强子-RARE模块或Cyp26a1本身的缺失，会改变RA引导的分化轨迹，减少神经外胚层进程，同时异常扩增未分化及间充质样细胞群体。综上，研究人员的研究定义了一个内源性增强子-RARE模块，该模块独特地调控Cyp26a1介导的RA清除。通过在分化过程中限制RA可用性，这一顺式调控机制作为关键的表观遗传检查点，稳定发育信号并确保细胞命运轨迹的精确执行。

一、研究背景与科学问题

维甲酸（retinoic acid，RA）是维生素A的活性代谢产物，作为一种关键的形态发生素，调控胚胎图式形成、区域特化和谱系进展。RA信号在细胞核内由维甲酸受体（retinoic acid receptors，RARα/β/γ）与维甲酸X受体（retinoid X receptors，RXRα/β/γ）形成的异源二聚体介导。配体激活后，RAR/RXR复合物结合RA反应元件（retinoic acid response elements，RAREs）并调控转录程序。RA的生物学效应对其剂量和暴露持续时间高度敏感：孕期维生素A缺乏可导致一系列发育缺陷，而过量RA或维甲酸暴露则具有致畸性，可干扰颅面、神经系统和心血管发育。这些观察强调了RA稳态的重要性，即受体依赖性转录需要与调控配体可用性的代谢途径相协调，从而限制RA信号的幅度和持续时间。然而，在多能细胞分化过程中，诱导性RA清除如何在内源性染色质中被编码，以及特定的远端顺式调控元件如何将受体占据与Cyp26a1激活偶联起来，此前仍不完全清楚。小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）提供了明确的初始多能状态、易于实验操作的分化体系和高效的基因组编辑工具，是解析RA信号、代谢反馈与早期命运进展之间关系的理想模型。

二、研究内容与主要结论

研究人员整合了时间分辨的批量及单细胞转录组学、顺式调控分析和遗传扰动，在mESCs中定义了一个位于Cyp26a1基因座的内源性RA响应调控模块。时间谱分析鉴定出Cyp26a1是RA驱动分化过程中诱导最强烈的基因之一。在参与RA合成与代谢的基因中，Cyp26a1以形成高度RA响应的远端增强子而独具特征。该增强子含有核心RARE基序，在RA暴露后通过RAR/RXR占据、p300募集、H3K27ac积累以及增强子-启动子相互作用的增强而被激活。遗传性破坏该增强子或其RARE基序会削弱Cyp26a1的诱导并改变RA响应性转录程序。在单细胞分辨率下，扰动Cyp26a1或其增强子-RARE模块会改变早期分化状态的分布，减少神经外胚层进程，同时增加未分化和间充质样细胞群体。跨基因型比较显示，Cyp26a1敲除、增强子敲除和RARE双敲除均导致神经外胚层相关分化减少，但严重程度存在差异。这些发现将RA清除的顺式调控控制与维持适当的发育响应联系起来，揭示了一个连接配体响应性染色质调控与Cyp26a1依赖性RA代谢反馈的内源性增强子-RARE模块。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：时间分辨的批量RNA测序（bulk RNA-seq）和单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq）以分析转录动态和细胞状态转变；染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和ChIP-qPCR检测H3K27ac、RARα、RXRα和p300在增强子区域的占据情况；Hi-C和4C-seq分析染色质三维结构和增强子-启动子相互作用；基于CRISPR/Cas9的基因组编辑构建Cyp26a1敲除、增强子敲除和RARE敲除细胞系；共免疫沉淀（co-immunoprecipitation）验证RARα、RXRα和p300的蛋白复合物形成；p300催化抑制剂A-485进行药理学干预；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）染色评估分化状态；RT-qPCR和蛋白质印迹（western blot）验证基因和蛋白表达水平。样本来源为小鼠胚胎干细胞系。

四、研究结果

1. 1.
   Cyp26a1作为阶段性RA驱动转录组重塑中的核心稳态效应因子

研究人员建立了RA时间梯度（0、12、24、48、72小时），进行批量RNA-seq和单细胞RNA-seq。时间分辨的差异表达分析显示广泛的转录重塑，每个相邻时间区间均出现大量基因激活和抑制。Cyp26a1被鉴定为诱导最强烈的基因之一，其mRNA和蛋白水平随时间显著升高。核心多能性调控因子Pou5f1、Nanog、Sox2和Esrrb逐渐下降，细胞周期和增殖相关基因广泛下调，上皮和间充质相关基因发生动态变化。将时间序列差异表达基因聚类为八个具有不同时间动力学的模块，涵盖代谢、发育、神经相关功能。基因本体（Gene Ontology，GO）分析显示RA诱导的基因富集于神经发育和图式形成，而下调基因富集于免疫、粘附和迁移相关过程。HOX家族基因表现出RA依赖性诱导和时间进展。

1. 2.
   RA引导早期谱系定向优先朝向神经外胚层命运

批量RNA-seq热图分析显示，RA暴露后泛外胚层、神经外胚层、表面外胚层、中胚层、内胚层和间充质相关基因集快速且时间有序地激活。单细胞整合UMAP分析鉴定了多个分子定义的细胞状态，包括ESC相关群体（未分化和na?ve样）和分化群体（神经外胚层样、内胚层样和间充质样）以及2C样群体。神经外胚层样群体表达Sox1、Pax6和Nes等神经标记，与保留Esrrb、Nanog、Pou5f1和Sox2高表达的ESC相关群体清晰分离。RA代谢和信号基因（包括Cyp26a1、Cyp26b1、Dhrs3、Stra6、Crabp1、Crabp2、Fabp5和RA受体）以及典型RA响应基因（Hoxa1、Hoxb1、Stra8）在细胞群体间呈差异分布。

1. 3.
   Cyp26a1缺失破坏RA响应性转录并重定向细胞命运轨迹

批量RNA-seq证实WT细胞中Cyp26a1强烈诱导，而敲除细胞在整个72小时时间过程中表达不可检测。Cyp26a1敲除细胞在RA处理后表现出更强的AP染色信号和不同形态，支持延迟或不完全退出未分化状态。敲除细胞中RA代谢、转运和胞内结合相关基因发生协调变化，下游RA响应基因和HOX家族基因表现出基因型依赖性时间差异。功能层面，敲除细胞中下调基因显著富集于神经相关和图式形成过程，包括轴突发生、图式特化、区域化和突触组织。单细胞RNA-seq显示敲除细胞中神经外胚层样群体比例减少，同时未分化ESC和间充质样群体扩增。

1. 4.
   远端Cyp26a1增强子作为RA核受体调控的调控枢纽

系统比较RA代谢相关基因座的H3K27ac谱和RARα/RXRα占据，发现Cyp26a1基因座的一个远端区域在RA暴露后获得强H3K27ac富集并被RARα和RXRα共占据。Hi-C接触图显示Cyp26a1启动子和远端增强子位于同一拓扑关联结构域（topologically associating domain，TAD）内。4C-seq以Cyp26a1启动子为视点，鉴定出启动子与含RA诱导H3K27ac峰的远端区域之间的可重复接触。在Rara/Rxra双敲除（Rar-DKO）细胞中，远端增强子的H3K27ac富集显著减少，增强子-启动子相互作用大幅减弱，证明RARα/RXRα活性对于增强子完全激活和高效增强子-启动子通讯是必需的。

1. 5.
   增强子内RAREs通过p300催化的H3K27ac许可RA驱动的Cyp26a1诱导

通过多模型基序扫描，在增强子内鉴定出两个非冗余候选RARE（RARE1和RARE2）。RA处理后，RARα和RXRα在RARE1和RARE2处特异性富集，p300也在相同位点显著富集。共免疫沉淀显示RA处理的WT细胞中p300与RARα和RXRα共免疫沉淀，这些相互作用在Rar-DKO细胞中缺失。遗传扰动实验中，增强子删除显著削弱RA诱导的Cyp26a1表达；单个RARE删除降低诱导幅度，而两个基序联合删除产生更强的削弱。在Rar-DKO细胞中，p300占据和H3K27ac富集均显著减少。使用p300催化抑制剂A-485处理不阻止p300占据，但显著减少H3K27ac富集并强烈抑制RA诱导的Cyp26a1表达，证明p300乙酰转移酶活性对于增强子乙酰化和Cyp26a1诱导是必需的。

1. 6.
   远端增强子删除触发RA驱动转录组的全局重编程并重塑早期命运格局

两个独立增强子敲除克隆中，Cyp26a1诱导幅度显著降低，CYP26A1蛋白丰度在48小时降至WT水平的约50%。增强子敲除细胞表现出广泛的差异基因表达，随时间推移转录差异更加显著。GO富集分析显示，48小时下调基因富集于神经相关功能类别，包括离子通道活性、神经递质代谢和突触可塑性调控。多个图式形成基因（Cdx2、Meis2和多个Hox基因）的动力学发生改变。单细胞RNA-seq显示增强子敲除细胞中未分化ESC和2C样细胞比例增加，神经外胚层样群体减少，呈现较温和的中间表型。

1. 7.
   RAREs作为调控RA代谢重编程和命运再分配的核心基因组决定因素

批量RNA-seq显示RARE双敲除（RARE-DKO）细胞中RA诱导的Cyp26a1表达在整个分化时间过程中显著减弱，蛋白水平在48小时大幅降低。RA响应性图式形成基因Hoxa1和Hoxb1的诱导在RARE-DKO细胞中减弱，多个其他Hox家族成员和RA响应基因（Cdx1、Meis2、Stra8）的诱导动力学也发生改变。谱系特征分析显示RARE-DKO细胞保留更高的多能性特征，外胚层相关评分降低，中胚层相关评分相对增加。RA稳态相关基因在48小时发生协调重塑，涉及代谢酶、转运蛋白、结合因子和多个Cyp26家族成员。GO分析显示下调基因富集于神经相关发育过程，包括轴突发生、突触组织和感觉系统发育；上调基因富集于发育图式形成、区域化和有机阴离子转运。单细胞RNA-seq显示RARE-DKO细胞中细胞状态组成发生显著改变，伴随单细胞水平Cyp26a1表达降低。

1. 8.
   跨基因型单细胞分析揭示Cyp26a1调控轴上趋同和不同的分化缺陷

联合整合WT、Cyp26a1-KO、Enhancer-KO和RARE-DKO细胞的单细胞转录组，解析了共同的早期分化状态集合。相对于WT细胞，所有三种扰动均使细胞偏离神经外胚层相关分化，但幅度不同：Cyp26a1-KO和RARE-DKO细胞表现出最强的未分化ESC和间充质样群体扩增以及神经外胚层样区室的显著耗竭，而Enhancer-KO细胞呈现较温和的中间表型。转录程序分析进一步区分了各扰动相关的分子响应，WT细胞保留更强的RA靶标活性，而突变基因型在多能性、RA信号、细胞周期和中胚层/间充质相关程序中表现出差异变化。

五、讨论与结论

该研究鉴定了一个内源性染色质机制，该机制在mESC的RA诱导分化过程中参与RA清除反馈。CYP26A1作为主要的RA分解代谢酶，由一个含有两个功能性RARE的高度RA响应性远端增强子控制。RAR/RXR占据这些基序促进p300募集、局部H3K27ac积累和高效的增强子-启动子通讯，从而支持完整的Cyp26a1诱导。遗传性破坏Cyp26a1、其远端增强子或增强子内嵌RAREs均一致地改变RA响应性转录程序并改变早期分化状态的分布。跨基因型单细胞分析揭示了神经外胚层相关分化的共同减少，伴随不同程度的未分化ESC和间充质样群体扩增。该研究将RA清除的顺式调控控制与维持适当的发育响应联系起来。增强子删除使CYP26A1蛋白降至WT水平的约50%，但对细胞状态组成的影响较完全Cyp26a1缺失或联合RARE删除更温和，表明转录扰动不一定与蛋白丰度或表型严重程度线性对应，信号-代谢回路具有缓冲和阈值样行为。CYP26家族成员的功能部分冗余可能提供额外补偿层面，但不足以阻止观察到的分化表型。该调控模块的逻辑可能超越早期胚胎发生，具有临床相关性：泛癌分析显示CYP26A1在多种人类恶性肿瘤中显著失调，其高表达与肾透明细胞癌等癌症的不良无病生存和总生存显著相关。总之，该研究定义了一个内源性增强子-RARE模块，该模块将配体响应性染色质调控与Cyp26a1依赖性RA代谢反馈联系起来，作为关键的表观遗传检查点，通过限制RA可用性稳定发育信号并确保细胞命运轨迹的精确执行。