可溶性鸟苷酸环化酶激活逆转肝窦内皮细胞衰老并通过HB-EGF旁分泌恢复淀粉样β40与LDL的肝清除

《Journal of Biological Chemistry》：Reversing liver sinusoidal endothelial aging restores clearance of amyloid-beta and LDL

　　

在健康肝脏中，大分子通过肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）窗孔自由进入Disse间隙。在衰老过程中，LSEC窗孔大部分丢失（假毛细血管化，pseudocapillarization）。研究人员假设，恢复衰老LSECs的窗孔可增强直径>50 nm的富含甘油三酯脂蛋白（triglyceride-rich lipoproteins，TRL）进入Disse间隙，而大多数循环淀粉样β（amyloid-beta，Aβ）与这些脂蛋白结合，并允许肝细胞摄取Aβ：在衰老大鼠中，两周的可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）激活剂cinaciguat恢复了窗孔；循环Aβ₄₀水平减半，恢复到年轻大鼠中的水平。令人意外的是，cinaciguat还逆转了年龄相关的低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）增加，而LDL是直径20-30 nm的较小脂蛋白，即使LSECs去窗孔也能穿过窦内皮屏障。因此，研究人员研究了LSECs促进肝细胞清除的额外机制。虽然原代肝细胞对Aβ₄₀或LDL的摄取极少，但在年轻大鼠LSEC条件培养基（conditioned medium，CM）中培养的肝细胞保留了其摄取功能。衰老大鼠LSEC条件培养基未能促进肝细胞Aβ₄₀和LDL摄取，但用cinaciguat治疗衰老大鼠恢复了衰老大鼠LSECs的旁分泌信号。研究人员发现，肝素结合表皮生长因子样生长因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor，HB-EGF）介导这种LSEC-肝细胞相互作用，并且HB-EGF由衰老大鼠LSECs合成但不分泌；cinaciguat治疗恢复衰老LSECs的HB-EGF分泌。治疗逆转了大鼠肝细胞中低密度脂蛋白受体（LDL receptor，LDLR）和低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LDL receptor-related protein 1，LRP1）表面表达的年龄相关丢失。本研究确定了一种候选疗法，用以应对循环Aβ和LDL的年龄相关增加，并阐明了控制这些现象的细胞间串扰机制。

研究背景与问题：健康肝脏中，大分子可经肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）窗孔自由进入Disse间隙；衰老时LSEC窗孔大部分丢失，即假毛细血管化（pseudocapillarization）。由于直径>50 nm的富含甘油三酯脂蛋白（triglyceride-rich lipoproteins，TRL）需经LSEC窗孔进入Disse间隙，而大多数循环淀粉样β（amyloid-beta，Aβ）与这些脂蛋白结合，因此衰老可能延迟TRL结合Aβ的肝清除。肝是清除循环Aβ的主要器官，年轻健康动物可清除注射Aβ的60%；循环Aβ大部分与脂蛋白结合，健康衰老中90%血浆Aβ₄₀和97%Aβ₄₂与脂蛋白结合，其中58%与TRL结合，23%与低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）结合，19%与高密度脂蛋白结合。周围清除下降时，周围和脑Aβ均增加。LRP1被认为是肝脏Aβ摄取的主要受体，但肝LRP1调控机制不清。另一方面，LDL和HDL直径较小，即使LSEC去窗孔也可穿过窦内皮屏障，因此衰老时LDL增加不能仅归因于LSEC孔隙丢失。LSEC的VEGF-一氧化氮（nitric oxide，NO）-可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC）-环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）通路调节其通透性；sGC激活可恢复慢性肝病中LSEC形态和功能，并恢复HB-EGF等旁分泌生长因子分泌。因此，研究人员假设sGC激活可使衰老、假毛细血管化LSEC恢复正常表型，促进TRL结合Aβ清除，并研究LSEC衰老如何损害肝细胞对小直径颗粒的清除。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员使用年轻与衰老Fischer大鼠，给予两周sGC激活剂cinaciguat，发现其可恢复衰老LSEC的cGMP水平、窗孔形态和内吞能力，并使循环Aβ₄₀、天然LDL和氧化LDL升高正常化。进一步体外研究发现，年轻大鼠LSEC条件培养基（conditioned medium，CM）可促进肝细胞摄取LDL和Aβ，而衰老大鼠LSEC-CM失去此作用；cinaciguat治疗衰老大鼠后，其LSEC-CM恢复旁分泌促进作用。研究人员发现HB-EGF介导LSEC-肝细胞信号，衰老LSEC合成但不分泌HB-EGF，cinaciguat恢复其分泌；肝细胞全细胞LDLR和LRP1表达不随衰老改变，但其质膜定位下降，cinaciguat治疗可恢复。该研究提出了一种候选治疗策略，并阐明LSEC-HB-EGF-肝细胞轴在肝清除Aβ和LDL中的作用，对心血管和神经退行性疾病具有重要意义。

关键技术方法：研究使用4月龄和24月龄雄、雌Fischer大鼠，样本分别来自Charles Rivers laboratories和NIAAA aging rodent colony。关键技术包括LSEC与肝细胞分离、LSEC条件培养基制备、肝细胞摄取实验、扫描电镜定量LSEC孔隙率、ELISA检测cGMP、Aβ₄₀、LDL、氧化LDL和HB-EGF、免疫印迹及肝细胞质膜蛋白分离、共聚焦显微镜，以及LRP1/HB-EGF中和抗体和重组HB-EGF干预。

研究结果：
可溶性鸟苷酸环化酶激活使衰老肝窦内皮细胞恢复正常表型。通过将衰老大鼠随机分配至两周溶剂对照或cinaciguat 0.3 mg/kg灌胃，检测LSEC cGMP、扫描电镜孔隙率和FITC-FSA内吞，发现cinaciguat可正常化衰老LSEC的cGMP，恢复窗孔和內吞功能。
Cinaciguat治疗使衰老相关的循环Aβ₄₀、天然LDL和氧化LDL升高正常化。通过ELISA比较年轻、衰老及cinaciguat治疗衰老大鼠血浆Aβ₄₀、血清LDL和氧化LDL，发现衰老大鼠Aβ₄₀、天然LDL和氧化LDL升高，cinaciguat治疗可逆转这些升高；氧化LDL下降可能与恢复LSEC内吞能力有关。
年轻而非衰老LSECs使肝细胞能够摄取Aβ和LDL。通过分离年轻大鼠肝细胞，与年轻、衰老或cinaciguat治疗衰老大鼠LSEC-CM共培养，检测DiI-LDL、Aβ₄₀-FAM和RAP-FITC摄取，发现年轻LSEC-CM促进肝细胞摄取，衰老LSEC-CM不促进，cinaciguat治疗衰老大鼠的LSEC-CM恢复促进作用；LRP1中和抗体可完全阻断年轻LSEC-CM对肝细胞Aβ摄取的旁分泌作用。
HB-EGF介导LSEC-肝细胞信号传导的年龄相关变化。通过ELISA检测LSEC上清可溶性HB-EGF（sHB-EGF）、免疫印迹检测pro-HB-EGF、共聚焦观察肝组织，以及重组HB-EGF和抗HB-EGF中和抗体干预，发现衰老LSEC合成但不分泌HB-EGF，cinaciguat恢复其分泌；HB-EGF是介导该LSEC-肝细胞信号的主要分子。
Cinaciguat治疗恢复肝细胞质膜LDLR和LRP1表达。通过分离年轻、衰老和cinaciguat治疗衰老大鼠肝细胞，免疫印迹检测全细胞和质膜LDLR、LRP1，发现衰老不改变全细胞LDLR和LRP1丰度，但降低其质膜表达；cinaciguat治疗可恢复质膜LDLR和LRP1表达。

讨论部分总结：该研究说明，在体内激活sGC足以逆转LSEC假毛细血管化；两周cinaciguat即可恢复LSEC窗孔、内吞能力和sHB-EGF释放。HB-EGF是此前未描述的旁分泌促进肝细胞LDL和Aβ摄取的因子，并介导LSEC-肝细胞共培养对LDL摄取的益处。该研究首次建立年龄相关肝脂蛋白受体定位与sGC-cGMP通路调控的直接联系。cinaciguat使循环Aβ、LDL和氧化LDL降至年轻大鼠水平；sGC激活剂靶向功能异常的氧化/无血红素sGC，在高氧化应激疾病中可能比sGC刺激剂更有效。LSEC表达PDE5，对PDE5抑制有反应，本研究可能解释PDE5抑制剂认知保护的周围机制。未来需研究sGC激动或磷酸二酯酶抑制在人体中提高细胞内cGMP的效率。转化研究需选择合适疾病模型；传统阿尔茨海默病和动脉粥样硬化性心血管疾病转基因模型多使用年轻动物，缺乏年龄相关假毛细血管化，且APP/PS1突变可降低肝LDLR和LRP1达80-90%，可能抵消增强肝清除的疗法。LSEC假毛细血管化在60岁后近乎普遍，是临床相关治疗靶点；肝比脑更易药物干预，而阿尔茨海默病试验失败率高。肝纤维化和代谢功能障碍相关脂肪性肝病是认知下降和痴呆风险因素，LSEC毛细血管化先于肝纤维化，与假毛细血管化表型相似，相同治疗可逆转LSEC毛细血管化。

研究结论翻译：总之，研究人员的工作发现了一条此前未描述的LSEC-肝细胞信号轴，其中LSEC HB-EGF作为旁分泌调节因子调节年轻肝细胞对Aβ和LDL的摄取。研究人员表明，衰老通过假毛细血管化和HB-EGF分泌受损破坏该通路。研究人员进一步首次证明，短期给予sGC激活剂可逆转LSEC假毛细血管化，正常化循环Aβ和LDL，恢复LSEC HB-EGF分泌，并重建衰老大鼠肝细胞LDLR和LRP1质膜表达，从而使LSEC旁分泌调节肝细胞对Aβ和LDL的摄取。总体而言，这些发现定义了一种新的、治疗上可操作机制，将肝血管衰老与脂质和Aβ稳态失调联系起来，对心血管和神经退行性疾病具有广泛意义。该研究由Sam J. de Leve、Xiangdong Wang、Helia Alavifard、Lily Dara和Laurie D. DeLeve完成。