《Journal of Chromatography A》：CCC and HPLC enrichment and GC-MS databasing of more than 20 furan fatty acids (FuFAs) from two fish oil ethyl ester fractions
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研究人员对两种鱼油乙酯（ethyl ester, EE）组分中的呋喃脂肪酸（furan fatty acids, FuFAs）进行了研究。首先进行初步富集，随后进行逆流色谱（countercurrent chromatography, CCC）分离。对三个CC
研究人员对两种鱼油乙酯（ethyl ester, EE）组分中的呋喃脂肪酸（furan fatty acids, FuFAs）进行了研究。首先进行初步富集，随后进行逆流色谱（countercurrent chromatography, CCC）分离。对三个CCC组分进一步采用非水反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC）进行分离。通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）在HPLC组分中检测到20种FuFA，其中包括多种极为稀有的FuFA。此外，研究人员开发了一种适用于40种FuFA甲酯（FuFA methyl ester, FuFA-ME）的GC保留时间预测工具。
**1. 研究背景与现存问题**
脂肪酸（fatty acids, FAs）在结构上具有高度多样性，除众所周知的饱和脂肪酸（SFAs）、单不饱和脂肪酸（MUFAs）和多不饱和脂肪酸（PUFAs）外，还存在多种在膳食中仅以微量形式出现的次要脂肪酸。其中，呋喃脂肪酸（FuFAs）因具有显著的自由基清除潜力而受到关注。在结构上，FuFAs由一条通常含12至16个碳原子的饱和羧基烷基链构成，链中嵌入一个α和α'位连接的呋喃环，该呋喃环在β位（M-FuFAs）或β和β'位（D-FuFAs）带有一个或两个甲基残基，对应总碳数（TC）分别为基本脂肪酸碳链数加5或6。
已有40余项研究检测了生物样品中的FuFAs，其中海洋生物和植物是主要研究对象。绝大多数研究仅报道了六种或更少的优势FuFAs，例如11D5（11-(3,4-二甲基-5-戊基呋喃-2-基)十一烷酸）在几乎所有基质中均为最丰富的FuFA。理论上，D-FuFA和M-FuFA的结构总数可达135种，但已有文献提及的不足一半。那些具有罕见链长（如偶数碳烷基链或偶数碳羧基烷基链）的FuFAs通常仅在个别研究中被偶然发现，且多经过选择性富集。研究这些稀有FuFA对于理解此类脂肪酸的生物合成途径具有潜在价值。然而，其分析面临诸多挑战：(i) 浓度极低（<1 mg/100 g脂肪酸甲酯），(ii) 易被高浓度脂肪酸信号掩盖，(iii) 缺乏参考标准品而难以可靠鉴定。因此，亟需开发有效的富集和分析策略来探索这些罕见FuFA的结构与分布。
**2. 研究目的与样本来源**
本研究的目的是对两种先前用于提取主要FuFA的PUFA乙酯（EE）鱼油进行稀有和不常见FuFA的富集及全面（非定量）分析。研究所用的两种鱼油乙酯组分由KD Pharma研发中心（德国贝克斯巴赫）提供，分别为富含二十二碳六烯酸乙酯（DHA-EE）和富含二十碳五烯酸乙酯（EPA-EE）的组分，已知其中含有多种FuFA-EE。
**3. 主要技术方法**
研究人员采用了多步联用策略。首先对鱼油乙酯进行氢化处理，将MUFA-EE和PUFA-EE转化为SFA-EE，该过程几乎不影响FuFA-EE；随后采用尿素络合去除直链饱和脂肪酸乙酯，获得初步富集的FuFA-EE组分。该富集产物进一步通过逆流色谱（CCC，一种半制备级、非破坏性分离技术，可进样高达1 g样品）分离为50个窄馏分。基于GC-MS全扫描筛查，选取三个含稀有FuFA、优势FuFA含量低且质量大于0.5 mg的CCC馏分，经转酯化为FuFA甲酯后，再采用非水反相HPLC进行精细分离。HPLC组分经GC-MS（全扫描和选择离子监测模式）分析，最终建立GC-MS数据库并开发保留时间预测工具。
**4. 研究结果**
**4.1 CCC富集FuFA-EE**
对粗DHA-EE油的分析显示11D5-EE含量约为1.4%，与文献报道的1.5%一致。经氢化和尿素络合处理后，6.1 g DHA-EE油得到133 mg富含FuFA-EE的残渣（FuFA占比47%）。该残渣经CCC预分离得到71.1 mg总质量，其中FuFA-EE占88%（62.4 mg）。相比之下，未处理油的CCC馏分中FuFA-EE仅占10%，且由于PUFA-EE干扰，仅能检测到六种已知FuFA-EE。处理油中FuFA-EE富集因子为88，较未处理油的7提高了近九倍，尽管处理过程中存在约30%的FuFA-EE损失。在DHA-EE和EPA-EE油的CCC馏分中，共检测到14种FuFA-EE，总碳数（TC）范围为17至22，占该理论结构范围（56种）的25%。其中，DHA-C26、DHA-C29和EPA-C7三个馏分因富含稀有FuFA、主FuFA干扰少且质量适宜而被选中进行后续HPLC分离。
**4.2 HPLC富集（稀有）FuFA-ME**
将选中的三个CCC馏分转酯化为FuFA-ME后进行非水RP-HPLC分离。GC-MS筛查显示，DHA-C26中的FuFA-ME检测数从六种增至十种，DHA-C29从四种增至七种，EPA-C7从三种增至十种，总计检测到20种不同FuFA（TC=18至22）。其中包含一种此前从未报道过的13D2-ME，以及八种具有偶数碳羧基烷基链或偶数碳烷基链的稀有FuFA（如8D5、10D5、11D2、9D4、9D6等）。以10D5-ME为例，其在粗油中含量约1.6 ppm，经氢化/尿素络合/CCC/HPLC全流程后，在单一HPLC进样中富集因子高达约83,000，实现了痕量FuFA的鉴定。HPLC保留体积随总碳数增加而增大，且M-FuFA-ME较同分异构的D-FuFA-ME洗脱更早，但部分同分异构体（如11D3/9D5）无法通过该HPLC体系分离。
**4.3 预测FuFA-ME的GC保留时间**
基于20种FuFA-ME的GC保留时间（tR）数据，研究人员建立了预测工具。将tR对羧基烷基链长（x=7至14）作图，分别按烷基链长（AC）和总碳数（TC）分组，获得两组线性回归方程。在三种不同GC-MS系统上验证发现，TC(x)的斜率在三系统间相似，而AC(x)的斜率受色谱柱类型影响。基于此，研究人员在Excel中构建了一个仅需输入单个实测值即可自动计算40种D-FuFA-ME理论tR的预测工具。以11D5-ME（x=11, tR=20.987 min）为参考，对15种D-FuFA-ME测试集的计算与实测tR偏差为0.01至0.13 min（平均值0.06 min），该精度在两周内不同浓度重复测量中表现优异。该工具还成功辅助鉴定出两个新的痕量M-FuFA-ME（9M6-ME和10M5-ME），其中10M5-ME为首次报道，且9M6-ME在文献中仅被描述过一次。即使在所属组内无任何已知FuFA的情况下，预测tR与实测值的偏差仅为0.02至0.05 min，证明了该工具的可靠性。
**4.4 不饱和FuFA（uFuFAs）**
在富集的CCC-HPLC组分中，研究人员通过提取诊断碎片离子检测到四种低浓度的u11D5-EE异构体（顺/反u11:1D5-EE和顺/反u11D5:1-EE），它们带有与呋喃环共轭的额外双键。在DHA-C29-H16组分中，进一步鉴定出四种u11M5-ME异构体，这些共轭uFuFA可能是在CCC分离后、HPLC分离前作为人为氧化产物形成的。此外，在DHA-C26-H17和DHA-C29-H17中检测到一类特殊的u11D5-ME异构体，其双键不与呋喃环共轭而是位于更远端（isol-u11:1D5-ME），其分子离子较饱和11D5-ME低2 u。此类具有隔离双键的uFuFA在文献中尚无报道。研究人员推测，这种隔离双键可能是生物合成过程中未完全饱和的痕迹，支持了FuFAs可由含三个或更多双键的PUFA生物合成、其中两个双键用于形成呋喃环、其余双键可能被保留的假说。然而，由于含量和纯度限制，未能通过NMR确证双键的具体位置。
**5. 讨论与结论**
CCC与HPLC的联用被证明是富集稀有FuFA的有效工具，氢化和尿素络合预处理则显著简化了富集步骤。研究表征了超过20种FuFA，并据此建立了CCC和HPLC中的洗脱次序规律。由于起始材料仅来自两种鱼油乙酯组分，可以推测FuFAs在自然界中可能存在更高的结构多样性。新开发的FuFA tR预测工具能够简便且可靠地预测FuFA-ME的GC-MS保留时间，有助于在缺乏标准品的情况下鉴定罕见FuFA。
值得注意的是，许多检测到的次要FuFA的存在和起源目前仍不清楚。例如，9D6与10D5虽然具有相同的总碳数（TC=21），但呋喃环位置不同，因此两者之间无法直接转换。尽管这些稀有FuFA可能源自PUFA，但在植物中合成此类稀有FuFA的生化前体仍难以解释。本文所建立的方法有望为阐明（稀有）FuFA的生物合成途径及其在自然界中的分布提供新的分析手段，填补相关认知空白。
