脂质纳米颗粒共递送人RB1 mRNA与雷公藤甲素用于视网膜母细胞瘤局部基因治疗

《Journal of Controlled Release》：Lipid nanoparticle-mediated co-delivery of human RB1 mRNA and triptolide for localized genetic therapy of retinoblastoma

摘要专业翻译 视网膜母细胞瘤是一种罕见的儿童眼内恶性肿瘤，由视网膜母细胞瘤转录辅阻遏物1（RB1）肿瘤抑制基因的双等位基因失活驱动。尽管基因替代疗法前景广阔，但玻璃体腔注射后核酸的高效递送仍面临挑战，这主要是由于玻璃体独特的微环境——其特点是蛋白质含量低、胶原蛋白-透明质酸网络致密。在此，研究人员开发了一种含C12-200的脂质纳米颗粒（CLNP），专为玻璃体腔基因递送而设计。通过系统优化脂质组成，研究人员确定了一种制剂，该制剂可同时促进玻璃体内的扩散、细胞内摄取以及人RB1 mRNA（hRB1-mRNA）与雷公藤甲素的共包封。与基于DLin-MC3-DMA（MC3）的对照脂质纳米颗粒（LNP）相比，CLNP在模拟玻璃体的低血清蛋白条件下维持了高效的mRNA递送，并通过以细胞膜穴样内陷/脂筏介导的内吞作用为主、巨胞饮作用为辅的途径进入细胞。在体外，CLNP介导的hRB1-mRNA与雷公藤甲素共递送产生了比任一单一疗法更强的抗增殖活性，并优于相应的MC3-LNP制剂。在原位视网膜母细胞瘤小鼠模型中，单次玻璃体腔注射hRB1-Trip-CLNP即可实现稳健的瘤内转基因表达，显著抑制肿瘤进展，并将肿瘤分级分布向更低级别偏移，且未引起可检测到的视网膜功能障碍、结构异常或凋亡细胞死亡。这些发现表明，CLNP作为一种针对玻璃体优化的平台，能够有效克服玻璃体腔基因递送的细胞外和细胞内屏障，从而实现对视网膜母细胞瘤的局部联合基因-药物治疗。这项工作为工程化设计用于眼部及其他部位局部核酸递送的LNP提供了通用策略。

论文解读文章

研究背景与问题

视网膜母细胞瘤是一种好发于婴幼儿的罕见眼内恶性肿瘤，其发病的根本分子机制是RB1肿瘤抑制基因的双等位功能缺失。尽管现有综合治疗方案（包括全身化疗、眼动脉化疗、玻璃体腔化疗及眼球摘除术等）取得了一定进展，但复发、视网膜毒性和视力丧失仍是临床面临的重大挑战。基因替代疗法旨在从病因层面恢复RB1蛋白功能，其中信使核糖核酸（mRNA）疗法因无需入核、无基因组整合风险且可实现可控的瞬时蛋白表达，成为极具吸引力的选择。然而，将核酸类药物成功递送至眼内靶细胞的核心瓶颈在于递送载体。玻璃体腔注射是实现眼局部给药、降低全身暴露的理想途径，但玻璃体本身构成了独特的物理化学屏障：其富含胶原蛋白-透明质酸的致密网络导致高粘度和有限的流体对流，同时蛋白质含量极低，限制了传统脂质纳米颗粒（LNP）依赖血清蛋白形成蛋白冠以介导受体介导摄取的能力。因此，为全身给药优化的传统LNP在玻璃体腔内往往扩散受限、细胞摄取效率低下。鉴于此，亟需开发一种专门针对玻璃体微环境进行工程化设计的LNP平台，以同时克服细胞外扩散和细胞内递送的双重障碍。

研究内容与结论

为解决上述问题，来自首尔大学的研究人员开发了一种含可电离脂质C12-200的脂质纳米颗粒（CLNP）。通过系统优化脂质组成，筛选出一种兼具优异玻璃体扩散性、高效细胞内递送能力并能同时包封人RB1 mRNA（hRB1-mRNA）与疏水性小分子药物雷公藤甲素的优化配方。研究表明，CLNP在模拟玻璃体的低蛋白条件下，其mRNA递送效率显著优于基于DLin-MC3-DMA（MC3）的对照LNP，且主要通过不依赖血清蛋白的细胞膜穴样内陷/脂筏介导的内吞途径进入细胞。体外实验证实，CLNP介导的hRB1-mRNA与雷公藤甲素共递送产生了协同增强的抗增殖效果。在原位视网膜母细胞瘤小鼠模型中，单次玻璃体腔注射共载hRB1-mRNA和雷公藤甲素的CLNP（hRB1-Trip-CLNP）实现了显著的瘤内转基因表达，有效抑制了肿瘤进展，且未观察到明显的视网膜功能或结构毒性。该研究为局部眼部基因-药物联合治疗提供了一个高效、安全的递送平台，并为其他眼科疾病的LNP工程设计提供了通用策略。该论文发表于《Journal of Controlled Release》。

主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：1. 脂质薄膜水化与冻融法制备LNP，以实现高浓度制剂并兼容玻璃体腔注射的有限体积；2. 动态光散射（DLS）表征纳米颗粒的水动力学直径、多分散性指数（PDI）及Zeta电位；3. QuantiFluor RNA系统定量测定mRNA包封效率；4. 紫外-可见分光光度法测定雷公藤甲素的包封效率；5. 离体猪玻璃体扩散实验结合小动物活体成像系统（IVIS）评估不同LNP制剂的玻璃体内空间分布；6. 流式细胞术与荧光显微镜定量和定性分析绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的表达水平及细胞摄取途径；7. 药理学抑制剂实验探究CLNP的细胞摄取机制；8. 原位视网膜母细胞瘤小鼠模型评估体内mRNA递送效率和抗肿瘤疗效，肿瘤进展通过视觉分级系统量化；9. 视网膜电图（ERG）、光学相干断层扫描（OCT）、苏木精-伊红（H&E）染色及末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析全面评价眼内生物相容性。

研究结果

1. 工程化设计适用于玻璃体的LNP用于玻璃体腔mRNA递送

通过调整C12-200摩尔比例（30%-60%）制备了四种LNP配方。离体猪玻璃体扩散实验显示，C12-200含量为50 mol%的#3 LNP展现出最佳的玻璃体内空间分布。在Y79视网膜母细胞瘤细胞中，#3 LNP介导的EGFP表达最高，且细胞毒性远低于商业化转染试剂Lipofectamine 2000。因此，#3 LNP被选为优化配方，命名为CLNP。

2. CLNP在模拟玻璃体低蛋白条件下维持高效mRNA递送

在热灭活胎牛血清（FBS）模拟的低蛋白条件下，CLNP介导的EGFP表达仅轻微下降（1.09倍），而MC3-LNP的递送效率则显著降低了约3.05倍。细胞摄取机制研究发现，抑制细胞膜穴样内陷/脂筏介导的内吞作用的染料木黄酮（GEN）处理显著降低了EGFP阳性细胞比例，而抑制巨胞饮的阿米洛利（AMI）有部分影响，抑制网格蛋白介导内吞的氯丙嗪（CPZ）则无明显作用。这表明CLNP主要通过不依赖血清蛋白的细胞膜穴样内陷/脂筏介导的内吞途径发挥作用。

3. CLNP实现hRB1-mRNA与雷公藤甲素的协调共递送以增强治疗效果

单独递送hRB1-mRNA对Y79细胞活力抑制微弱。在确认游离雷公藤甲素与hRB1-mRNA（经Lipofectamine 2000递送）联用具有协同增效作用后，研究人员比较了共载配方。结果显示，hRB1-Trip-CLNP在72小时时将细胞活力降至约50%，显著优于游离雷公藤甲素（约70%）和hRB1-Trip-MC3-LNP。此外，序贯给药并未优于同时共递送，支持了将两种治疗剂共封装于同一CLNP中的策略。

4. CLNP用于局部联合基因-药物疗法的体内验证

在原位视网膜母细胞瘤小鼠模型中，CLNP介导的EGFP mRNA递送在肿瘤组织中产生强烈的EGFP表达，而Lipofectamine 2000和聚乙烯亚胺（PEI）则几乎无效。在治疗实验中，单次玻璃体腔注射hRB1-Trip-CLNP显著抑制了肿瘤生长，肿瘤分级分布明显向低级别偏移，效果优于游离雷公藤甲素或hRB1-CLNP单药治疗，也优于相应的MC3-LNP共载配方。ERG、OCT、H&E染色和TUNEL分析均未检测到任何视网膜功能或结构损伤，证明CLNP具有良好的眼内生物相容性。

总结与结论

本研究成功开发了一种名为CLNP的C12-200脂质纳米颗粒平台，它专门针对玻璃体微环境的独特生物学限制进行了工程化设计。与传统主要为全身给药优化的LNP不同，CLNP通过系统优化脂质组成，在保持强大细胞摄取和胞内mRNA递送能力的同时，促进了其在蛋白质贫乏的玻璃体中的高效转运，从而同时克服了玻璃体腔给药后的细胞外运输和细胞内递送障碍。

为展示该平台的治疗多功能性，研究人员以hRB1-mRNA和雷公藤甲素作为临床相关的模型治疗药物进行联合基因-药物治疗，在视网膜母细胞瘤中实现了增强的抗肿瘤疗效，且在评估期间未引起可检测到的视网膜功能障碍、结构异常或细胞凋亡增加。重要的是，单次玻璃体腔给药即实现了稳健的转基因表达和显著的肿瘤抑制，凸显了这种局部治疗策略的转化潜力。

除了视网膜母细胞瘤，这项工作建立了一种通用的制剂策略，即专门为玻璃体微环境而非简单改编全身递送系统来设计脂质纳米颗粒。通过同步优化在玻璃体中的细胞外运输和向靶细胞的胞内递送，这种面向玻璃体的脂质工程策略为mRNA及其他核酸治疗药物的局部递送提供了一个广泛适用的框架，从而拓展了非病毒基因疗法在遗传性视网膜疾病及其他后段眼病中的应用潜力。