厌氧带果发酵（anaerobic in-cherry fermentation）通过重塑绿咖啡糖、游离氨基酸和挥发物前体提升烘焙咖啡果香、醇厚度和酸度

《Journal of Food Composition and Analysis》：Higher fruitiness in roasted coffee through in-cherry fermentation: the role of fermentation-induced changes in green coffee

　　

厌氧发酵显著改变了咖啡生豆中糖和游离氨基酸组成。采后处理强烈影响了烘焙咖啡风味化学。Strecker醛、醇类、有机酸和酯类是厌氧处理的标志物。发酵增强了杯中的果香、醇厚度和酸度。

Jaloliddin Khushvakov等开展的研究围绕采后带果发酵对绿咖啡化学组成及烘焙咖啡风味化学的影响。研究背景在于，精品咖啡市场持续增长，消费者对新风味的需求增加，采后处理创新被认为可产生强烈果香。传统上可按干燥阶段区分自然处理、水洗处理和去皮自然/蜜处理；近年出现完整咖啡果入罐发酵，如碳酸浸渍或带果发酵（in-cherry fermentation），可在发酵后加入或不加入二氧化碳（CO₂），随后可作自然果干、去果皮带羊皮纸干燥或带残留果胶干燥；共发酵亦在研究。问题在于，尽管绿咖啡中发酵衍生代谢物如醇、酯、有机酸和醛可增强果香和甜感，但烘焙仍是决定香气的关键步骤，既有研究更多关注烘焙诱导香气，而对发酵影响的理解相对不足；比较不同采后处理时也常主要关注烘焙诱导化合物，仅近期才较系统定量绿咖啡中的发酵诱导化合物。同时，研究人员认为当前采后处理术语不够精细，提出分别描述预干燥过程与干燥过程，并采用双重命名，如厌氧带果发酵果干（anaerobic in-cherry fermentation-fruit dried, AN-FD；完整咖啡果密闭发酵后带果干燥）、水洗-羊皮纸干燥（washed-parchment dried, W-PD）和自然-果干（natural-fruit dried, N-FD）。研究目的是以稳定同位素稀释分析（stable isotope dilution analysis, SIDA）结合顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS）分析绿咖啡与不同烘焙度咖啡的挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs），区分烘焙诱导、烘焙与发酵共同诱导以及发酵诱导化合物，说明发酵和烘焙共同影响烘焙咖啡香气组成。研究结论表明，AN-FD显著改变绿咖啡非挥发性化学组成，并影响烘焙过程中的香气形成；前体修饰在调节最终感官特征中具有重要作用。受控采后处理可调节杯型，并可通过延长带果发酵提高果香和酸度。

主要关键技术方法：样本来自肯尼亚 Chepsangor Hills Coffee farm，2022年末收获的 Coffea arabica L.（Rubiaceae），为Baitan、Ruiru 11和SL28混合，选成熟红果。处理包括W-PD、N-FD和AN-FD；AN-FD在密封罐发酵120 h至pH 4，再果干30天。分析绿咖啡水分、密度、粒径与CHN；用UHPLC-MS/DAD定量糖、游离氨基酸（free amino acids, FAAs）、葫芦巴碱、有机酸、咖啡因和绿原酸（chlorogenic acids, CGAs）；用ROEST L100烘焙至不同Colorette值；用SIDA HS-SPME-GC-MS定量acetaldehyde、guaiacol、2,5-dimethyl-3-ethylpyrazine、3-methylbutanal和acetic acid，并以2,5-dimethyl-3-ethyl-d₅-pyrazine归一化半定量VOCs；由Q-graders进行感官强度评价；统计采用Kruskal-Wallis、Dunn和主成分分析（principal component analysis, PCA），使用R软件。

研究结果：
3.1 绿咖啡分析（Green coffee analysis）：通过绿咖啡非挥发物分析，AN-FD总游离糖为9.35% DW，低于W-PD的10.90% DW和N-FD的11.36% DW；蔗糖在AN-FD降低，葡萄糖和果糖在两种果干过程较高。AN-FD游离氨基酸为1.00% DW，高于N-FD的0.86% DW和W-PD的0.69% DW，其中异亮氨酸/亮氨酸为N-FD和W-PD的3.3至4.6倍。AN-FD蛋白质较低，苹果酸较低，乳酸较高，总有机酸最高；绿原酸、咖啡因和葫芦巴碱无差异。AN-FD密度最低，W-PD最高；W-PD豆粒较大。结论是延长带果发酵导致糖水解或降解、蛋白降解和有机酸转化。

3.2 挥发性化合物（Volatile compounds）：通过SIDA HS-SPME-GC-MS和归一化半定量，共检测220种VOCs，分属呋喃衍生物、呋喃醛、吡嗪、吡咯和吡啶、酚和愈创木酚、含硫化合物、醛酮、酯、醇、有机酸、萜烯、烃类等。五种精确定量物中，acetaldehyde和guaiacol为烘焙诱导，形成主要受烘焙强度决定；2,5-dimethyl-3-ethylpyrazine、acetic acid和3-methylbutanal受采后处理影响，并在浅烘中已较高。

3.3 烘焙诱导化合物（Roast induced compounds）：通过比较不同烘焙度，呋喃衍生物随烘焙加深指数增加，AN-FD略低；呋喃醛在中烘达到峰值后向深烘略降，AN-FD略低，与绿咖啡糖较低一致。吡嗪在绿咖啡中几乎不存在，烘焙早期形成并保持较稳定，AN-FD最高，尤其烷基、三取代或四取代吡嗪；AN-FD绿咖啡中已检测到少量四甲基吡嗪等。愈创木酚和酚随深烘指数增加，三种处理动力学相似，其前体无显著差异。酮类随深烘增加，AN-FD总体最低，但2,3-丁二酮、2-庚酮、3-辛酮和乙偶姻已在两种果干绿咖啡中出现。

3.4 烘焙诱导与发酵诱导化合物（Roast-induced and fermentation-induced compounds）：通过醛类和酯类分析，醛类虽在绿咖啡已有，但主要在烘焙中产生，烘焙AN-FD最高。Strecker醛如2-甲基丙醛和2-甲基丁醛在浅烘AN-FD最高，与缬氨酸等前体较高一致。脂质氧化醛如己醛、庚醛、壬醛和(E)-2-壬烯醛在两种果干过程浅烘最高，并随深烘下降。部分酯在烘焙中增加，AN-FD绿咖啡已有微量甲酯；苯乙酸甲酯和甲酸苯乙酯在深烘AN-FD最高，与苯乙醇在AN-FD绿咖啡中较高有关。

3.5 发酵诱导化合物（Fermentation-induced, FI）：通过绿咖啡和烘焙咖啡VOCs比较，酯类在AN-FD绿咖啡最高，N-FD次之，W-PD几乎缺失。乙酯和乙酸酯在AN-FD绿咖啡中丰富，部分在绿咖啡和浅烘AN-FD中水平相当，说明可经历烘焙而保留。乙酯如ethyl acetate、ethyl isobutyrate、ethyl butanoate、ethyl 2-methylbutanoate、ethyl isovalerate和ethyl phenylacetate被认为可增强果香；乙酸酯如isobutyl acetate、isoamyl acetate和phenylethyl acetate亦高。AN-FD中甲基和乙基水杨酸酯高。杂醇如2/3-methylbutan-1-ol和phenylethyl alcohol在AN-FD绿咖啡和烘焙咖啡中高，并随深烘略降。含氧单萜如cis-linaloloxide和linalool在AN-FD绿咖啡和烘焙咖啡中较高；1-octen-3-ol可能源于真菌活动或亚油酸氧化。结论是发酵诱导酯、醇、有机酸等在采后阶段已形成，并部分保留至烘焙咖啡。

3.6 感官评价（Sensory Evaluation）：通过Q-graders对同一中烘度样品进行强度评价，AN-FD最为突出，果香平均8.5，醇厚度7，甜度6.5，酸度8，并带有蔓越莓、黑加仑、樱桃、热带水果和发酵水果等复杂水果描述；其涩感也最高。N-FD果香7.5，酸度6.3，醇厚度5.7，复杂度较低；W-PD多数属性最低。三种咖啡坚果、烘焙和苦味均低，巧克力样风味中等。结论是感官结果与AN-FD中较高酯类和有机酸一致。

3.7 主成分分析（PCA analysis）：通过归一化GC-MS数据的PCA，AN-FD与N-FD和W-PD明显分离，N-FD靠近W-PD。PC2主要解释发酵诱导挥发物差异，酯、有机酸、Strecker醛、醇和含氧单萜在AN-FD更丰富；PC1主要解释烘焙影响，如呋喃衍生物、呋喃醛、酮、酚和愈创木酚衍生物。少数糖降解产物在W-PD和/或N-FD较高而AN-FD较低。总体而言，AN-FD中的挥发物也存在于N-FD，主要差异是AN-FD发酵诱导挥发物强度更高；其精确来源尚不清楚。

讨论部分总结：讨论整合绿咖啡非挥发物、烘焙挥发物、感官和PCA结果，指出AN-FD与两种传统处理的差异主要由发酵诱导前体和挥发物变化驱动；糖、游离氨基酸、有机酸等前体变化影响烘焙香气形成，酯、醇和有机酸等发酵诱导物可保留至烘焙并贡献果香、酸度和醇厚度。

研究结论翻译：本研究表明，与传统文化处理相比，厌氧带果发酵果干处理（AN-FD）对绿咖啡非挥发性化学组成及烘焙过程中香气形成具有显著影响。该发现凸显前体修饰在调节最终感官特征中的重要作用。AN-FD绿咖啡非挥发组成不同于两种传统处理，其特征为较低糖、较低蛋白和较低苹果酸，而游离氨基酸、单糖和发酵源酸升高。这表明带果延长发酵启动了AN-FD绿咖啡内部生化降解与转化过程，也影响烘焙过程中的挥发物形成。虽然大多数烘焙诱导化合物在三种咖啡中形成速率相似，且呋喃、呋喃醛和吡嗪仅有较小差异，但若干烘焙诱导化合物如Strecker醛3-甲基丁醛在AN-FD中升高，可能由AN-FD绿咖啡中如亮氨酸等游离氨基酸含量较高解释。此外，若干发酵诱导化合物如酯、醇和有机酸在绿AN-FD咖啡中升高，可能在采后处理阶段已经形成。这些发酵诱导化合物经历烘焙过程后仍存活，因此可能贡献AN-FD烘焙咖啡所感知的较高果香。因此，受控采后处理是调节杯型特征的有效方法，并为咖啡生产者提供通过延长带果发酵时间提高咖啡果香和酸度的选择。进一步研究需要区分带果发酵与干燥期间发酵过程对观察到的组成变化的相对贡献。此外，虽然相对定量表明AN-FD中果香酯显著升高，仍需绝对定量确认这些发现，并确定其气味活性值（odor activity values, OAVs）是否足够高以影响感官感知。因此需要互补的嗅闻分析来鉴定贡献重发酵咖啡果香特征的特定酯类。