永生化人表皮角质形成细胞系在三维皮肤与表皮建模中的转化适用性：HaCaT、N/TERT-1与N/TERT-2G的前景、挑战和局限

《Journal of Investigative Dermatology》：Immortalized keratinocyte cell lines for tissue engineered 3D skin and epidermal modeling: prospects, challenges, and limitations

　　

永生化人表皮角质形成细胞（keratinocytes, KCs），包括HaCaT、N/TERT-1和N/TERT-2G角质形成细胞，正日益被用作原代人角质形成细胞的替代物，以制备表皮和全层皮肤等效物（skin equivalents）。使用永生化细胞系需要对其基因型（genotypes）和功能特征进行严格评估，以确定其在体外（in vitro）模拟表皮的适用性。在此，研究人员评估了关于HaCaT、N/TERT-1和N/TERT-2G角质形成细胞以及其他永生化角质形成细胞系不断积累的循证实验数据，以帮助皮肤生物学界选择最适合用于模拟表皮和皮肤的细胞。

论文解读

研究背景：20世纪70年代，Howard Green和James G. Rheinwald首次成功实现人表皮角质形成细胞（keratinocytes, KCs）体外培养，但原代KCs传代次数有限，供者来源可耗竭，限制长期体外实验、可重复性以及基因工程等需延长培养的技术。20世纪80年代末，自发永生化KC系HaCaT出现并广泛进入皮肤病学研究；2000年代初，Rheinwald研究组通过逆转录病毒载体将人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）基因导入新生儿包皮原代KC系“strain N”，建立N/TERT-1和N/TERT-2G。此后，Ker-CT、KHAT、NHEK/SVTERT3-5、NHK-E6/7和NEB-1等永生化KC系也被开发。问题在于，并非所有永生化KC系都同样适合研究表皮生物学的各个方面，尤其HaCaT和N/TERT数据积累较多，其他细胞系尚缺乏多研究组优化和验证。因此，研究人员评估HaCaT、N/TERT-1、N/TERT-2G及其他永生化KC系的基因型、功能特征及2D/3D模型适用性，为皮肤病学研究选择合适细胞提供依据，并强调永生化KC在减少动物实验、标准化表皮模型方面的意义。

关键技术方法（≤250字）：研究人员基于已发表实验数据进行循证评估和比较，不开展新的样本队列实验；重点比较HaCaT、N/TERT-1、N/TERT-2G及其他永生化KC系的基因型、功能特性、2D单层培养和3D器官型培养（organotypic cultures, OTCs）。3D模型包括在胶原包被塑料滤膜上构建人表皮等效物（human epidermal equivalents, HEEs），以及含成纤维细胞填充真皮组分的全层人皮肤等效物（human skin equivalents, HSEs）。评估指标包括组织学分层、分化与增殖标志物如KRT1、KRT10、丝聚蛋白（filaggrin, FLG）、内披蛋白（involucrin, IVL）、转谷氨酰胺酶-1（transglutaminase-1, TGM1）和Ki67，屏障功能通过电阻抗谱评估，并涉及OECD化学刺激测试。细胞来源需注明：HaCaT来自62岁男性上背黑色素瘤周边；N/TERT来自同一新生儿包皮供体“strain N”；其他包括新生儿包皮、腹部NHEK、青少年NHEK等。

研究结果：

永生化HaCaT KCs：来源与特征。HaCaT由Boukamp等从62岁男性上背切除黑色素瘤的周边边缘分离，为自发永生化KC系；形态接近正常人类表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes, NHEK），在塑料上具高集落形成效率，可维持超过140代。HaCaT表达KRT5和KRT14，保留部分终末分化能力，表达KRT1、KRT10、IVL和FLG。其核型为异倍体，可在含血清简单培养基中生长，并缺乏细胞周期调节因子p16^INK4A和p53。与NHEK相比，HaCaT在细胞因子刺激后关键表皮分化标志物表达显著不同；单层培养接近汇合时，KRT1/KRT10和IVL表达分别延迟约2天和5天。OTCs中HaCaT不能正常终末分化，表现为颗粒层细胞不扁平、角化不全和蛋白表达异常，如KRT6出现、KRT1和KRT10定位不规则。

HaCaT KCs在2D细胞培养模型中的应用。HaCaT被用于研究紫外线、活性氧、毒理、炎症信号、皮肤再生和伤口愈合。与NHEK类似，HaCaT对UV损伤激活DNA修复和抗氧化机制，不可修复损伤则激活凋亡；对活性氧上调超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。其稳健、易用和低成本适合高通量筛选，用于细胞毒性检测和药物开发，并符合动物研究“替代、减少、优化”原则。HaCaT也通过MyD88、MAPK、JAK、NF-κB、激活蛋白-1和信号转导与转录激活因子等通路响应炎症刺激，增加CXCL8、CXCL10和ICAM-1等表达。研究人员还利用HaCaT研究维生素D、TGF-β、整合素、钙黏蛋白、伤口愈合、细胞外囊泡激活MAPK、生物凝胶或生物活性基质释放生长因子或微小RNA等。遗传操作包括过表达YY1、RNA干扰、患者特异性变异、HRAS变异、miR-203等，但需注意HaCaT中p53功能已改变，p53信号研究应在NHEK中验证。

HaCaT KCs在3D皮肤和表皮等效物中的应用。HaCaT可形成多层上皮，含基底层和棘层，但缺乏颗粒层和角质层；HaCaT来源OTCs不能完全分化并形成适当角质层，角质包膜蛋白如FLG和loricrin异常，对钙响应差。与成纤维细胞共培养、机械和气液暴露、优化钙和血清浓度等策略可部分改善，但鉴于形态表型差，研究人员建议不要在3D表皮或全层皮肤等效物中使用HaCaT KCs。

永生化N/TERT-1和N/TERT-2G KCs：来源与特征。N/TERT-1和N/TERT-2G由Rheinwald实验室用hTERT逆转录病毒转导同一新生儿包皮供体“strain N”的NHEK建立；N/TERT-1为潮霉素抗性，N/TERT-2G为嘌呤霉素抗性，二者无需抗生素维持永生化。端粒长度稳定是逃避衰老的必要但不充分条件，还需CDKN2A去抑制导致p16^INK4A和p14^ARF表达，细胞通过自发遗传事件或工程化逃避该机制。N/TERT仍可被诱导终末分化，并在OTCs中完全复层。其形态类似NHEK，但分化延迟，FLG、loricrin、KRT1、TGM1、cystatin 6和late cornified envelope 1A表达延迟，OTC中比NHEK来源模型延迟约2天。N/TERT-1为47, XY +20，N/TERT-2G为46, XY；N/TERT-1和N/TERT-2G在K-SFM中每天群体倍增分别为0.92和0.76。N/TERT-1对脂多糖刺激反应更强，IL1α和IL-6蛋白表达更高。培养介质显著影响表型，CnT-Prime和EpiLife支持高增殖均一培养，KGM加生长因子和K-SFM支持中等增殖异质集落并在接触抑制时分化，需密切跟踪汇合度。

N/TERT KCs在2D细胞培养模型中的应用。N/TERT被证明可作为NHEK的可持续替代，用于信号通路、皮肤癌、病毒感染、药物和毒理测试及紫外线研究。例如，PPARβ/δ激活诱导终末分化，芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AHR）激活后分化依赖Sirtuin-1；划痕实验中迁移行为类似NHEK。N/TERT被用于基因敲除或过表达、表达癌基因模拟恶性进展、研究基底细胞癌和鳞状细胞癌早期阶段。N/TERT-1对表皮生长因子转录反应增强，可能与EGFR表达较高有关。其遗传编辑扩展至罕见皮肤病如狼疮、寻常型鱼鳞病和丑角样鱼鳞病。N/TERT适合研究人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）和单纯疱疹病毒感染，并可用CRISPR/Cas9敲除ABCA12、WRN、FLG、claudin-1、AHR、AP-2 alpha等基因。药物毒理中N/TERT-1因寿命长适合高通量筛选，但高级临床阶段仍需更准确模型。N/TERT-2G单层还用于评估SasG介导金黄色葡萄球菌粘附角质细胞。

N/TERT KCs在3D皮肤和表皮等效物中的应用。N/TERT高度适合生成OTCs，如HEEs和全层HSEs，并忠实模拟人表皮，类似NHEK HEEs。HEE中N/TERT在Transwell系统胶原包被滤膜上气液暴露后终末分化，形成基底层、棘层、颗粒层和篮网状角质层；KRT2、KRT10、FLG、IVL、TGM1和Ki67表达类似NHEK HEEs并已与人表皮验证。N/TERT HEEs角质层较NHEK HEEs薄，可能与供者变异有关，不一定表示劣于NHEK。电阻抗谱显示NHEK和N/TERT HEEs均形成功能性表皮屏障。N/TERT HSEs含表皮和真皮组件，可研究KCs、成纤维细胞、黑素细胞和朗格汉斯细胞互作。炎症性皮肤病如特应性皮炎和银屑病可在N/TERT OTCs中建模，Th2细胞因子IL-4和IL-13及IL-17A和/或IL-22刺激后出现过度增殖、角化不全和屏障受损，类似NHEK，并可被AHR激动剂tapinarof及JAK1/JAK3抑制剂tofacitinib部分挽救。病毒感染研究中，IL-4/IL-13刺激N/TERT-1 HEEs后紧密连接相关屏障缺陷增强病毒穿透。细菌互作中，金黄色葡萄球菌刺激上调IL-1B、CCL20、抗菌肽PI3和DEFB4A，但需注意N/TERT OTCs基线SKALP表达在健康未感染体内皮肤中未观察到。N/TERT OTCs还用于OECD化学刺激测试、辐射损伤和DNA损伤研究，显示其稳健、易操作且高度代表正常皮肤。

N/TERT KCs的局限。需考虑来源、成本和获取限制。N/TERT来源于新生儿包皮，可能不同于成人其他解剖部位皮肤；新生儿包皮原代KCs的抗菌肽SKALP基线高于成人KCs，且男性来源无法考虑性别变量。N/TERT保留NHEK的特定生长因子和营养需求，需EpiLife、CnT-PR或K-SFM等较昂贵培养基，成本可能限制发展中国家采用。学术研究者获取N/TERT-1和N/TERT-2G需原创建者James G. Rheinwald许可，并需同意不用于商业用途或工业实验室；限制由Brigham and Women’s Hospital和Massachusetts Institute of Technology施加，未来需与Brigham and Women’s Hospital签署材料转移协议。James G. Rheinwald继续协助从全球学术实验室获取N/TERT，最主要来源为Radboud University Medical Center实验皮肤病学实验室；这些细胞系未来是否可授权给公司仍不确定。

其他永生化KC细胞系。除HaCaT和N/TERT外，Ker-CT、KHAT、NHEK/SVTERT3-5、NHK-E6/7和NEB-1等永生化KC系已被使用，但发表数量有限，尚未被多个研究组优化和验证，因此不宜对其优劣作强结论。永生化策略包括hTERT、hTERT加细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4, CDK4）、猴病毒40（simian virus 40, SV40）大T抗原、SV40大T抗原加hTERT、HPV E6/E7，以及p16^INK4A抗性CDK4加显性负p53加hTERT、BMI1加hTERT和Rho激酶抑制剂Y-27632短暂“永生化”。Ker-CT来自新生儿包皮，经CDK4和hTERT序贯过表达，可达至少285群体倍增，但OTCs常出现透明角质颗粒缺失、角化不全和异常分化。KHAT由NHEK经慢病毒hTERT和SV40大T抗原转导，OTC中表皮可分层，KRT10表达上基底层，但角质层紊乱，未充分验证。NHEK/SVTERT3-5来自腹部NHEK，经SV40大T抗原和hTERT永生化，分化基因和蛋白可类似NHEK，但多项OTCs研究显示细胞层紊乱、细胞间空泡、颗粒层难见、角化不全和FLG降低，尽管可形成有限功能屏障。NHK-E6/E7来自青少年NHEK，经HPV E6/E7慢病毒转导和嘌呤霉素选择，可形成复层但较薄，基底层紊乱。NEB-1来自单纯型大疱性表皮松解症患者健康亲属，经HPV16 E6/E7永生化，单层模型较多，OTCs少且常无角质层、颗粒层难辨。总体上，这些细胞系可用但OTC常不理想，优化培养条件可能提高与NHEK和体内人皮肤的可比性；建立HSE或HEE时，应以3至4个NHEK供体OTCs和体内人皮肤进行组织学、形态、关键分子定位与表达及功能屏障验证。

讨论部分总结：永生化KCs因增殖能力强、适合基因工程等高强度培养，已弥补NHEK来源有限的问题。HaCaT易培养但OTC中不能完全分化并形成足够角质层，故不适合3D表皮模型；其单层试验仍有价值，但不能完全反映体内终末分化。N/TERT-1和N/TERT-2G能形成完全分化、复层和角化表皮，更适合研究表皮稳态和屏障功能，并在组织学、标志物表达和屏障功能上最好地模拟人表皮。其他永生化KC系数据有限，OTC常不理想，需优化和验证。使用永生化KCs还必须考虑来源差异、单一遗传背景和无法代表人群多样性等问题，建议用至少3至4个NHEK供体验证。

研究结论翻译：永生化人角质形成细胞，如HaCaT和N/TERT，革新了皮肤研究，使许多无法获得NHEK的研究者能够开展皮肤研究。与NHEK相比，永生化KCs因在细胞培养中的增殖能力而具有若干优势，可支持基因工程等耗时培养流程。HaCaT细胞因增殖率高而易于培养，但由于不能完全分化并形成足够角质层，不能用于OTCs。HaCaT在多种单层试验中表现良好，但其在OTCs中的功能可能因缺乏终末分化而不能反映体内情况。皮肤是三维组织，KCs的空间组织和分化状态对其功能至关重要。N/TERT-1和N/TERT-2G更适合研究表皮稳态和屏障功能，因为它们能形成与NHEK来源表皮或体内人皮肤相当的全分化、复层和角化表皮。虽然NHEK是研究皮肤病学的金标准，且HaCaT自20世纪80年代以来已成为皮肤研究主流，但目前N/TERT-1和N/TERT-2G正取代HaCaT，成为学术研究实验室中首选的永生化KCs，因为它们更类似NHEK并适合生成天然皮肤样OTCs。作为最广泛使用的永生化KCs，使用HaCaT或N/TERT的实验可在实验室间良好比较，并可作为室间对照；方案可在实验室间互换，不仅便于直接比较，也便于排除故障。使用永生化KCs时需考虑其来源：N/TERT来源于包皮KCs，可能在生物学和功能上不同于腹部或乳房等其他部位KCs。此外，永生化KCs代表单一遗传背景，不能捕获人类群体中的遗传多样性、种族和变异性，因此不太适合研究群体水平反应和开发个性化医学方法。因而建议用至少3至4个NHEK供体验证永生化KCs的实验发现。目前，N/TERT-1和N/TERT-2G在体外复制人表皮方面领先，因为与其他永生化KC系相比，它们最好地捕获了人表皮的组织学、标志物表达和屏障功能。现有数据提示，N/TERT-1和N/TERT-2G应成为产生HEE和HSE的首选细胞系。然而，N/TERT细胞来源于新生儿组织；因此，从不同解剖部位和种族的成人KCs开发永生化KC系将极大促进皮肤病学研究。