Bombus terrestris作为Vairimorpha (Nosema) ceranae的次优宿主：实验暴露后胞内发育受限的证据

《Journal of Invertebrate Pathology》：Bombus terrestris as a suboptimal host for Vairimorpha (Nosema) ceranae: Evidence of limited intracellular development following experimental exposure

　　

Bombus terrestris作为Vairimorpha (Nosema) ceranae的次优宿主：实验暴露后胞内发育受限的证据
• 实验暴露显示V. ceranae在Bombus terrestris中的胞内发育有限。
• 组织病理学（histopathology）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和PTP3（polar tubule protein 3）逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）提供了寄生虫发育的互补证据。
• 胞内寄生虫阶段稀疏且异质分布于心室上皮（ventricular epithelium）内。
• PCR阳性频率显著高于转录活跃寄生虫阶段的证据。
• 有限的寄生虫发育可能影响B. terrestris在V. ceranae传播中的作用。

研究背景与问题：传粉者健康对生物多样性和农业生产力至关重要。熊蜂（Bombus spp.）是重要传粉者，Bombus terrestris（简称B. terrestris，熊蜂）常见且广泛分布，但受病原体等威胁。管理蜂与野蜂共享花资源可促进病原跨宿主传播。Vairimorpha (Nosema) ceranae（简称V. ceranae，微孢子虫病原）最初描述于Apis cerana，后在全球Apis mellifera中检测到，并可见于熊蜂、无刺蜂和其他野蜂。此前PCR在B. terrestris等检测到V. ceranae DNA，提示其可能为宿主，但DNA检测不能区分无活性孢子、消化道短暂通过、环境污染和宿主组织内活跃复制。PTP3（polar tubule protein 3，极管蛋白3）在孢子形成后半段表达，可作为活跃复制标记。Gisder等组织学研究未在实验接种B. terrestris中检测到活跃感染，因此需结合分子、转录和超微结构证据，确定V. ceranae能否侵入B. terrestris心室上皮并建立胞内发育。

研究开展、结论与意义：研究人员开展两个独立接种试验，结合光镜、TEM、传统PCR和PTP3 RT-qPCR。结果显示，多数接种个体PCR阳性，仅部分个体PTP3阳性；组织病理和TEM显示稀疏、异质分布的胞内寄生虫发育阶段。结论为B. terrestris可支持V. ceranae有限胞内发育，但可能是次优宿主，低PTP3阳性频率和稀疏分布表明实验条件下发育受限。其意义在于强调区分病原检测与活跃感染，提示不同传粉者宿主能力不同，可能不对称影响V. ceranae维持和传播。

关键技术方法：研究人员设置两个独立接种试验。第一试验使用商业繁育B. terrestris colony，由Agrobio S.L.提供，实验前确认无Vairimorpha spp.感染；10只年轻成年工蜂接种10 μL V. ceranae孢子悬液（4.09 × 10⁵ spores/μL），16 dpi取样，6只肠道用于光镜和TEM。第二试验使用实验室由野捕蜂王建立的B. terrestris群体；18只工蜂接种相同剂量，12只接受无孢子蔗糖溶液作为sham对照；对全部个体进行传统多重PCR检测V. ceranae、V. apis、V. bombi，并用RT-qPCR检测V. ceranae PTP3转录；自然死亡个体也收集并?80 °C保存用于分子分析。接种物自自然感染A. mellifera工蜂分离、Percoll?离心纯化、PCR鉴定并定量。

研究结果：3.1 组织病理学检查：光镜观察接种B. terrestris心室显示嗜碱性胞内结构，符合成熟V. ceranae孢子，位于心室上皮细胞胞质；半薄切片广泛检查显示这些结构稀疏分布。结合TEM鉴定胞内裂殖体（meronts，微孢子虫胞内发育阶段），提供16天实验期内寄生虫发育证据；含这些结构细胞内未观察到空孢子。
3.2 透射电子显微镜超微结构表征：半薄切片广泛检查后选择区域TEM，发现稀疏分布感染上皮细胞含发育阶段；胞内meronts位于心室上皮细胞。感染细胞增大，线粒体和游离核糖体增多，若干线粒体围绕发育meronts质膜；未观察到空孢子。
3.3 寄生虫DNA分子检测与寄生虫复制：传统PCR在18只接种熊蜂中17只（94.4%）检测到V. ceranae DNA，1只阴性；RT-qPCR在6只（33.3%）检测到PTP3转录，提示活跃复制。10只存活至采样个体中4只PTP3阳性（7 dpi五只中1只，14 dpi五只中3只）；8只自然死亡中2只PTP3阳性。PTP3阳性个体转录浓度变异大，最高C-10于7 dpi为2.46 × 10^?11 ± 1.17 × 10^?11 ng/μl cDNA；14 dpi阳性范围9.84 × 10^?15 ± 1.66 × 10^?14至2.31 × 10^?13 ± 3.20 × 10^?13 ng/μl cDNA；自然死亡两阳性个体转录量最低。所有sham对照V. ceranae PCR和PTP3 RT-qPCR阴性；所有实验个体V. apis和V. bombi阴性。第二试验早期死亡集中在接种后最初几天：接种组8/18（44.4%）在4 dpi内死亡，sham组5/12（41.7%）。

讨论总结：研究人员认为，V. ceranae可侵入B. terrestris心室上皮、胞内复制并完成发育周期，但增殖相对A. mellifera等更慢，符合次优/近期宿主。感染细胞频率极低且局灶，需广泛组织检查才易发现；未观察到胞内发芽或细胞间传播，也未检测到空孢子，尽管使用高接种剂量（4.09 × 10⁶ spores per bumblebee）。与A. mellifera仅149 spores per bee可感染、1.25 × 10⁵ spores per bee 3天后可见空孢子，以及A. florea 1 × 10⁴ spores per bee广泛感染相比，B. terrestris明显更不敏感。PTP3结果说明DNA阳性不等于活跃感染；一些PCR阳性个体可能仅肠道管腔携带孢子。研究限制包括组织病理/超微结构与分子试验使用不同蜂群和队列、第一试验TEM meronts不能同个体分子确认、样本量有限、早期死亡率高、接种物感染力未独立评估、自然死亡个体mRNA可能降解。讨论还指出，暴露后行为/生理效应不一定需要广泛复制，可能源于孢子暴露、早期/局灶感染或宿主反应；B. terrestris低宿主能力可能降低其病原扩增和持续贡献，但低能力不等于生态后果可忽略，重复暴露或短暂感染仍可能产生免疫和能量成本。不同传粉者宿主能力差异可能导致不对称传播。未来需更大cohort、直接评估感染力和发育，并判断有限复制是否产生可存活孢子及传播给同巢。

研究结论翻译：本研究提供实验证据，表明在实验暴露后，Vairimorpha (Nosema) ceranae在Bombus terrestris中发生有限的胞内发育。通过结合组织病理学、透射电子显微镜、传统PCR和靶向PTP3基因的寄生虫特异性RT-qPCR，研究人员在多数接种个体中检测到V. ceranae DNA，而仅在子集中检测到转录活性证据。组织病理和超微结构分析进一步揭示心室上皮内稀疏分布的胞内寄生虫发育阶段。总之，这些发现表明B. terrestris能够支持V. ceranae的有限胞内发育，但PTP3阳性个体频率低和寄生虫阶段稀疏分布提示在所采用实验条件下发育受限。这些结果强调，在评估传粉者群落中宿主-寄生虫关联和潜在跨物种传播时，区分病原检测与活跃寄生虫发育证据的重要性。需要进一步研究，使用更大实验队列并直接评估寄生虫感染力和发育，以确定B. terrestris支持V. ceranae发育并促使其传播的程度。