《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Targeted Mass Spectrometry for Absolute Quantification of Total Human β?Nerve Growth Factor in the Development of a Bispecific Therapeutic Antibody
编辑推荐：
•混合免疫亲和/液相色谱-质谱联用（IA/LC-MS）分析方法在NGF蛋白生物标志物检测中表现出优异灵敏度•新型分析方法设计提高了方法的稳健性和生命周期管理能力•经全面验证的分析方法应用于应对复杂的药物开发挑战•临床生物标志物数据为临床转化提供了有力支持引言神经生长因子（NG
- •
混合免疫亲和/液相色谱-质谱联用（IA/LC-MS）分析方法在NGF蛋白生物标志物检测中表现出优异灵敏度
- •
新型分析方法设计提高了方法的稳健性和生命周期管理能力
- •
经全面验证的分析方法应用于应对复杂的药物开发挑战
- •
临床生物标志物数据为临床转化提供了有力支持
引言
神经生长因子（NGF）因其促进神经元存活和分化的重要作用而广为人知[1]、[2]、[3]。近几十年来，它也被认为是疼痛的介导者和调节因子[4]、[5]、[6]、[7]。一些临床研究已证明多种抗NGF抗体在治疗骨关节炎（OA）、糖尿病性疼痛性神经病（PDN）和慢性腰背痛中的疗效[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。这种临床疗效需要足量的抗NGF抗体以中和循环中的NGF。
MEDI7352是一种双特异性融合蛋白，由结合NGF的单链可变区片段（scFv）组成，通过人免疫球蛋白G1的恒定重链域2和3连接至肿瘤坏死因子（TNF）受体2[14]。MEDI7352的scFv NGF结合结构域能有效中和NGF，阻止其与高亲和力和低亲和力受体——肌凝蛋白相关激酶A（TrkA）和p75神经生长因子受体——的相互作用。为评估药物与靶点之间的药代动力学（PK）-药效动力学（PD）关系，评估靶点结合是关键，尤其对于NGF而言。因此，一种定量分析游离或总NGF的检测方法对于MEDI7352的临床开发至关重要。
配体结合试验（LBA）广泛用于内源性蛋白的定量分析，特别是在分析物低丰度存在（即低于纳克/毫升水平）的情况下[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。一个核心挑战是在药物存在的情况下，找到能够共同结合靶点且表位不重叠的抗体对，同时提供所需的灵敏度。在实际应用中，由于靶点-药物复合物可能干扰测量，在高循环药物浓度下难以定量分析靶点。液相色谱（LC）-质谱（MS）技术的进步扩大了蛋白质定量的选择。特别是，免疫亲和（IA）捕获与LC-MS整合的混合方法可将灵敏度提高至纳克/毫升水平或更低[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。要在过量药物存在的情况下测量总可溶性靶点，IA-LC-MS仅需一种能够从生物基质中回收游离和药物结合的靶点的捕获试剂；捕获的靶点随后通过LC-MS以自下而上的工作流程进行定量[26]、[27]、[28]、[29]。与LBA相比，这种策略对试剂的依赖性较小，在过量药物存在的情况下分析药物靶点具有优势。然而，对于总NGF而言，需要达到超低灵敏度——即低皮克/毫升范围，因为基线血清浓度处于此范围内[30]，而这通常通过LC-MS难以实现。
有几种策略可以进一步提高LC-MS分析的灵敏度。一种方法是在MS分析前增加分析物的富集和纯化。例如，在蛋白和肽水平上进行顺序亲和捕获已被用于提高灵敏度：首先捕获完整蛋白并进行消化，然后选择性地重新捕获产生的特征肽。Neubert等人使用这种顺序捕获工作流程开发和应用于总NGF检测[31]。在此方法中，一种靶向NGF特征肽的抗肽多克隆抗体被固定在线免疫亲和柱中，并与LC-MS系统整合（纳米流LC连接到Sciex 4000 QTRAP系统），从而实现每次进样都进行在线肽富集，并能够处理每次运行的高提取样本负载量。Tria等人也在受监管的生物分析环境中实施了该方法，以支持抗NGF抗体治疗药物的临床开发[32]。
尽管顺序亲和捕获过去取得了成功，但该分析对多克隆抗肽抗体的依赖损害了其性能的一致性，并给长期生物分析支持带来了可持续性风险。此外，实现所需分析灵敏度所需的600 μL血清体积相对较高。当代临床项目，尤其是涉及双特异性抗体治疗的项目，通常需要同进行多种分析，从而限制了可用于总NGF分析的样本体积。因此，需要一种减少样本输入量并避免依赖抗肽抗体的总NGF检测方法。
在此，我们描述了一种独特的互补方法，利用液相色谱（LC）和质谱（MS）仪器中的先进技术，如微流LC系统连接到Sciex 7500 QTRAP系统，在总NGF定量的创新工作流程中实现。通过优化的样品制备，进一步提高了MS灵敏度。为减轻在抗肽抗体临床开发过程中管理该分析生命周期的固有风险，我们用离线固相萃取（SPE）进行样品纯化替代了在线抗肽免疫亲和富集。此外，我们将输入样本体积减少至200 μL以提高患者中心性，同时实现10 pg/mL的分析灵敏度，这是定量基线NGF所需的。这种新型IA-LC-MS混合分析工作流程经成功验证，并应用于支持双特异性抗体MEDI7352的临床开发（图1）。
这种用于蛋白质和肽的新型混合LC-MS方法以及分析验证和样本分析中的分析严谨性也可应用于更广泛的研究领域。例如，已有大量关于膳食和植物来源中小分子生物活性物质（包括生物活性蛋白/肽）的报道，这些物质在多种疾病的治疗中显示出良好的治疗效果[33]、[34]。对这些化合物的严格表征对于食品和研究医学应用至关重要。
段落摘要
材料
重组人NGF（>97%经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测）和生物素标记的山羊多克隆抗NGF抗体购自R&D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）。序列特异性稳定同位素标记（SIL）肽IDTACVC(V*)(L*)SR（V*[13C5; 15 N]; L* [13C6; 15 N]; 总质量偏移13 Da），该肽含有胰蛋白酶切割位点，由Vivitide（美国肯塔基州路易斯维尔）合成。SIL肽标准品以1毫克分装提供，纯度>95%。
NGF定量分析方法策略
LBA是人类血清中NGF定量的常用方法[37]；然而，当靶向NGF的药物在样本中呈高浓度存在时，分析性能会受损[38]。由于NGF是一种相对较小的蛋白质（单体为13.5 kDa），难以找到不竞争且不与NGF结合药物竞争的抗体对。一种替代方法是用MS检测替代检测抗体，这有可能不受NGF结合分子的影响。在此……
结论
我们描述了利用IA-LC/MS混合方法开发、验证和实施一种新型、超灵敏且可靠的人β-NGF生物分析检测方法。通过使用SPE进行消化后纯化和微LC中的捕集-洗脱，该分析在未使用定制抗肽抗体的情况下实现并保持10 pg/mL的灵敏度。该策略缩短了试剂生成和分析开发的时间，并减轻了长期试剂供应风险。该分析已经……
利益冲突声明
所有作者在本研究进行时均为阿斯利康员工，并可能持有该公司的股票、期权和/或利益。
CRediT作者贡献声明
Anish Bhandari：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，调查研究，数据整理，概念构思。Enowmpey Enowtambong：撰写——审阅与编辑，可视化，数据整理。Zhiling Zhang：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，调查研究，数据整理，概念构思。Weiping Shao：撰写——审阅与编辑，监督，资源，概念构思。
竞争利益声明
作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所述工作。
致谢
感谢阿斯利康的Keith Tan、Fraser Welsh、Richard Jenkins、Craig Stovold、Rachel Schiffenbauer和Karl Navarro的支持。感谢BioRender绘制图1和图2。
Zhiling Zhang|Anish Bhandari|Enowmpey Enowtambong|Weiping Shao
