松萝酸通过激活Nrf2-HO-1通路并抑制HMGB1/NF-κB炎症轴及内质网应激减轻顺铂诱导的大鼠卵巢氧化损伤

《Kuwait Journal of Science》：Attenuation of cisplatin-induced oxidative ovarian injury by usnic acid in rats through inhibition of inflammation and endoplasmic reticulum stress

　　

顺铂（cisplatin, CIS）的临床应用受其潜在卵巢毒性限制。松萝酸（usnic acid, UA）通过诱导核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf₂）-血红素加氧酶1（heme oxygenase-1, HO-1）通路激活改善顺铂（CIS）诱导的氧化应激（oxidative stress, OS）。松萝酸（UA）抑制顺铂（CIS）诱导的炎症性高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1, HMGB1）/核因子κB（nuclear factor-kappa B, NF-κB）轴。松萝酸（UA）抑制顺铂（CIS）诱导的内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）和凋亡（apoptosis）。松萝酸（UA）显著恢复顺铂（CIS）诱导的卵巢损伤。

研究背景：癌症仍是全球主要死亡原因，治疗进展使过去三十年生存率提高20%。化疗方案提高生存率，但仍需寻找针对毒性尤其是生殖系统毒性的有效补救措施。顺铂（cisplatin, CIS）自1978年全球用于睾丸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌等。其经典抗癌机制是嵌入癌细胞DNA，通过链内和链间相互作用形成DNA加合物抑制复制；新信息表明CIS通过增加细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）加速凋亡。CIS临床应用受神经、肾、耳和卵巢毒性限制。卵巢是受CIS毒性影响最显著的器官之一，CIS化疗导致卵巢损伤、卵泡储备下降、早发性卵巢功能不全和绝经，降低女性生育潜力。细胞内应激反应包括氧化应激（oxidative stress, OS）、线粒体功能障碍、内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）、炎症和凋亡参与CIS毒性。CIS卵巢毒性主要特征为ROS升高，消耗还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）池，抑制抗氧化系统包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx），最终通过脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO）导致细胞损伤。ROS增加激活核因子κB（nuclear factor-kappa B, NF-κB）信号，增加促炎肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）水平和白细胞浸润，后者以髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）升高为特征。CIS还降低糖酵解通路酶如磷酸果糖激酶-1，降低细胞ATP。OS、炎症和ATP耗竭共同降低内质网蛋白折叠能力，导致ERS和凋亡。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf₂）是氧化还原敏感转录因子，是细胞保护基因主调控因子，包括SOD、GPx和血红素加氧酶1（heme oxygenase-1, HO-1）。近期研究表明抑制CIS诱导的Nrf₂通路促进CIS毒性。研究关注天然产物次级代谢产物的抗氧化和Nrf₂调节活性及其对CIS毒性的保护潜力。地衣是真菌成分和光合藻或蓝细菌的共生体，产生比其他天然产物更多的次级代谢产物。松萝酸（usnic acid, UA）是二苯并呋喃衍生物，在Usnea、Lecanora和Flavocetraria等属中浓度较高，具有抗菌、抗炎和抗氧化特性。UA在吲哚美辛诱导的胃损伤和甲氨蝶呤诱导的肺损伤模型中显示组织保护作用。但UA是否能对CIS相关器官毒性发挥保护作用尚不清楚。因此，本研究旨在通过在生化和组织学水平纳入Nrf₂信号通路分析，评估UA在CIS诱导的卵巢毒性模型中的化学预防潜力。

研究人员使用30只成年雌性Sprague-Dawley大鼠建立CIS卵巢毒性模型，并给予UA。得出UA通过调节Nrf₂通路抑制OS、炎症和ERS过程，并逆转卵巢组织病理结构和血清抗米勒管激素（anti-mullerian hormone, AMH）水平下降。该研究首次探索UA对CIS相关卵巢毒性的化学预防作用和潜在机制，提示UA可能作为对抗CIS毒性效应的有前景保护分子，但在推荐临床使用前需更全面的分子技术支持的生化和生理实验。

关键技术方法：样本队列来源为30只成年雌性Sprague-Dawley大鼠，实验经Karadeniz Technical University动物研究伦理委员会批准（编号2021/48）。阴道涂片确定动情期后随机分为五组：vehicle control、CIS、CIS+UA（5和10 mg/kg）及UA（10 mg/kg）。第一天单次腹腔注射CIS（5 mg/kg）建立卵巢毒性模型，随后连续三天腹腔注射UA。第5天处死，取卵巢和血。卵巢组织匀浆后用二喹啉甲酸法测蛋白。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测定OS、炎症、ERS和凋亡标志物及血清AMH；比色法测丙二醛（malondialdehyde, MDA）和总氧化状态（total oxidant status, TOS）。苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色进行组织学检查，半定量评分。统计采用SPSS 23.0，one-way ANOVA和Tukey检验。

研究结果：
3.1 UA inhibited OS process in CIS-intoxicated rats：通过检测卵巢氧化和抗氧化参数发现，CIS组TOS和MDA显著升高，GSH、SOD和GPx显著受抑。低剂量UA（5 mg/kg）改善LPO和TOS，但不足以支持抗氧化系统；高剂量UA（10 mg/kg）显著再生抗氧化系统，同时抑制LPO和TOS。单独高剂量UA未引起氧化损伤。
3.2 UA modulated Nrf₂ signaling in CIS-intoxicated rats：CIS组卵巢Nrf₂、HO-1和NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NAD(P)H:quinone oxidoreductase-1, NQO-1）水平显著降低。低剂量UA仅显著改善NQO-1；高剂量UA恢复所有Nrf₂信号成分。
3.3 UA suppressed inflammatory process in CIS-intoxicated rats：CIS注射加重卵巢炎症。UA尤其10 mg/kg显著抑制CIS诱导炎症。单独高剂量UA未引起炎症过程。
3.4 UA alleviated ERS and apoptosis in CIS-intoxicated rats：CIS组ERS和凋亡生物标志物显著高于对照。UA剂量依赖性显著降低ERS和凋亡。单独高剂量UA未引起ERS和凋亡病理。
3.5 UA restored histolopathological architecture and serum AMH levels in CIS-intoxicated rats：组织学显示对照和单独高剂量UA组卵巢正常。CIS组严重充血和水肿，卵巢结构退化，血清AMH显著降低。UA尤其10 mg/kg大体恢复组织病理和血清AMH水平。

讨论部分总结：讨论指出CIS广泛用于化疗但卵巢毒性风险大。已有resveratrol、syringic acid、zingerone和icariin等天然化合物研究。UA在吲哚美辛胃损伤和甲氨蝶呤肺损伤模型中显示强抗氧化和保护作用，但其对CIS卵巢毒性作用未知。本研究首次提出UA在CIS卵巢毒性模型中有化学预防作用。CIS模型成功：CIS组组织学破坏和AMH降低。UA 10 mg/kg抵消组织病理并恢复AMH。AMH由小生长卵泡产生，比月经周期激素更敏感反映卵巢储备；CIS导致卵巢衰竭、卵泡凋亡、AMH分泌下降等。本研究用半定量组织学评分和AMH，未来需综合生育相关激素、卵泡形态、窦卵泡计数和卵巢体积。OS方面，CIS增加ROS引起LPO和MDA，MDA破坏抗氧化酶；Nrf₂在OS下从Kelch样ECH相关蛋白1释放并激活靶基因，增加HO-1、NQO-1、SOD和GPx。CIS抑制Nrf₂，高剂量UA增加Nrf₂和抗氧化组分。炎症方面，HMGB1在炎症时释放，结合Toll样受体4（Toll like receptor 4, TLR4）和/或晚期糖基化终产物受体（Receptor for advanced glycation end-products, RAGE）激活NF-κB，增加TNF-α；CIS组HMGB1/NF-κB/TNF-α轴激活，MPO升高，UA改善炎症。Nrf₂是NF-κB负调节因子，CIS组Nrf₂降低而NF-κB升高。ERS方面，氧化还原失衡、炎症、营养和ATP不足导致未折叠蛋白积累和ERS；结合免疫球蛋白蛋白（binding immunoglobulin protein, B?P）通常保持激活转录因子6（activating transcription factor 6, ATF6）失活，未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）时解离，ATF6高尔基切割激活并迁移核，诱导恢复蛋白稳态基因；若不能恢复，ATF6增加生长停滞和DNA损伤诱导基因153（growth arrest and DNA damage-inducible gene 153, GADD153），改变Bcl-2样蛋白4（Bcl-2-like protein 4, Bax）/B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2, Bcl-2）比，启动ER相关凋亡。CIS加重ERS和凋亡，UA剂量依赖性消除；Nrf₂控制ER相关降解系统，CIS组ERS/凋亡高而Nrf₂抑制支持该机制。局限性包括UA高剂量肝毒性，本研究用低剂量；5天评估；多数用ELISA商业试剂盒，未来需RT-PCR、Western blot和/或免疫组化；AMH为间接指标，未来需更多激素和卵泡参数；未评估性行为。

结论翻译：本研究首次为UA在CIS诱导的氧化性和炎症性卵巢损伤实验模型中的潜在治疗作用提供机制性理解。研究结果表明，给予UA，特别是10 mg/kg剂量，可促进卵巢抗氧化系统，从而减轻OS、炎症、ERS和凋亡水平。还提示该效应可能至少部分归因于UA逆转CIS对Nrf₂/HO-1通路的抑制。这些发现首次证明UA可作为对抗CIS毒性效应的有前景的保护分子。然而，在推荐UA用于临床之前，需要更全面的分子技术支持的有力生化和生理实验研究。