《Journal of Extracellular Vesicles》：Tissue-Specific Isolation of Hepatocyte Extracellular Vesicles From Human Plasma Enables Tissue-Resolved Proteomic and miRNA Profiling
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组织特异性分辨仍是精准医学液体活检中的关键障碍。为解决这一问题，研究人员开发了NEXPLOR（新型细胞外囊泡群体组学揭示器，Novel EXtracellular vesicle PopuLation Omics Revealer），这是一种免疫亲和平台，能够
组织特异性分辨仍是精准医学液体活检中的关键障碍。为解决这一问题，研究人员开发了NEXPLOR（新型细胞外囊泡群体组学揭示器，Novel EXtracellular vesicle PopuLation Omics Revealer），这是一种免疫亲和平台，能够选择性富集循环组织特异性细胞外囊泡（TS-EVs），本研究以肝脏来源的肝细胞囊泡（h-EVs）为例进行验证。通过计算机模拟发现和跨组织正交抗体验证，研究人员鉴定出一个四标志物组合（ASGR1、ASGR2、TFR2、SLCO1B1），该组合可选择性地富集肝细胞囊泡，且不会共捕获占主导的血小板和白细胞囊泡背景。在肝细胞癌（HCC）、非癌性肝硬化和健康供体的临床队列中，NEXPLOR比全囊泡分离多回收了57%的蛋白质，且可重复性更高。通过恢复组织背景，h-EVs揭示了全囊泡遗漏的肝脏生物学，涵盖三个层面：代谢通路（碳代谢、HIF-1α信号、铁死亡）、HCC特征蛋白（PGD、H2AZ1、PRDX5）以及进展追踪候选标志物（CFB、PCSK9）。小RNA测序检测到5个在HCC与肝硬化h-EVs相比上调的miRNAs，而全囊泡中有21个（无重叠）；然而，只有h-EV miRNAs映射到HCC相关信号，且肝细胞调控的miR-124-3p仅在h-EVs中出现。总之，这些结果确立了组织特异性EV富集作为在HCC、肝硬化及其他亟需无创生物标志物用于患者诊断、监测和分层的疾病中实现更具可操作性的多组学液体活检的途径。
**论文解读：NEXPLOR平台用于血浆肝细胞特异性细胞外囊泡分离及组织分辨的蛋白质组和miRNA分析**
液体活检在精准医学中扮演重要角色，但当前基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的方法对某些肿瘤敏感度不足，且常依赖事先组织取样。细胞外囊泡（EV）由活细胞主动分泌，携带蛋白质、核酸等多种分子，可作为获取组织来源信息的非侵入性载体。然而，血浆中EV高度异质，常规分离方法（如超速离心、聚合物沉淀、尺寸排阻色谱）只能获得“全囊泡”（bulk EV），稀释了组织特异性信号。免疫亲和捕获可富集特定组织来源的EV，但既往研究缺乏对捕获标志物的正交验证，也未能明确相对全囊泡分离的优势。为此，研究人员开发了NEXPLOR（Novel EXtracellular vesicle PopuLation Omics Revealer）平台，以肝脏为模型，建立从血浆中特异性富集肝细胞来源EV（h-EV）的方法，以提升液体活检的组织分辨力。相关成果发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。
在技术方法上，研究人员首先利用MCF-7和BT-474细胞系来源EV验证了NEXPLOR的CD9+ EV捕获效率；随后通过Human Protein Atlas（HPA）等公共数据库进行计算机模拟筛选，结合Human Proteome Map和ProteomicsDB的蛋白质组数据，选出81个肝脏/肝细胞富集的质膜蛋白候选，其中23个进入抗体验证。采用O-NEXOS超敏表面标志物检测平台，在肝脏（健康、HCC、肝硬化）和非肝脏（肺、肾、乳腺、脂肪、肌肉）组织来源EV中逐步筛选，最终确定ASGR1、ASGR2、TFR2、SLCO1B1四种抗体组成的TOP4捕获组合。临床队列包括蛋白质组子集（13例HCC伴肝硬化、10例肝硬化、6例健康供体）和RNA测序子集（8例HCC、8例肝硬化、4例健康供体）；血浆经尺寸排阻色谱（SEC）获得全囊泡后，每例样本均分为两份，一份直接作为全囊泡，另一份经NEXPLOR TOP4免疫捕获得到h-EV，进行配对比较。蛋白质组采用timsTOF SCP液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），小RNA测序采用NEXTFLEX V4建库和NextSeq 2000测序。
研究结果如下：
**NEXPLOR Efficiently Isolates CD9+ EV Subtypes Without Altering CD9 Protein Affinity**：与商业Exo-Flow试剂盒相比，NEXPLOR捕获后上清中CD9+ EV几乎检测不到，而Exo-Flow未能有效捕获；两次连续捕获显示NEXPLOR颗粒回收率达97%，证实其高效特异性捕获。
**Bioinformatic Workflow Guides Identification of Hepatocyte-Specific EV Capture Markers**：通过整合mRNA和蛋白质表达数据，筛选出81个质膜蛋白候选，经抗体可行性评估后23个进入验证，最终聚焦TOP4。
**NEXPLOR Preferentially Enriches Hepatocyte-Derived EVs From Human Tissues and Plasma**：在组织EV验证中，TOP4组合能显著区分肝脏与非肝脏来源EV（最高平均倍数变化），而CD63捕获无此区分；在血浆中，TOP4未富集血小板（CD41+）和白细胞（CD45+）EV，但显著富集ASGR1/ASGR2阳性的肝细胞EV，且患者与健康供体表现一致。
**NEXPLOR h-EV Isolation Enhances Proteomic Depth and Reproducibility While Enriching EV Pathways and Reducing Contaminants**：配对比较显示，h-EV样本共定量到3386个蛋白质群（PG），其中1417个仅在h-EV中，296个仅在全囊泡中；h-EV平均获得3090个PG，全囊泡为1969个（多57%）。h-EV的技术重复性更好，主成分分析明显分离。差异分析显示h-EV富含EV/膜相关GO条目，而全囊泡富集血液污染物相关条目；血小板、白细胞和红细胞标志物在h-EV中显著耗减。
**H-EV Isolation Enriches EV and Hepatocyte Proteins and Reveals Metabolic Pathways Missed in Bulk EVs**：h-EV中MISEV2023定义的跨膜和胞质EV标志物（如LAMP1、LAMP2、CD82）显著富集，而脂蛋白和分泌蛋白在全囊泡中富集。肝细胞特异性酶ARG1和肝特异性转运体SLC22A9（OAT7）在h-EV中显著富集。KEGG分析显示h-EV富集的PG主要涉及碳代谢、氨基酸生物合成、糖酵解/糖异生和HIF-1α信号等肝脏代谢通路，而全囊泡则富集细胞外基质受体相互作用、胆固醇代谢及补体/凝血级联（后者富集倍数达33.8）。
**H-EV Isolation Enriches HCC- and Cirrhosis-Associated Pathways Within Paired Patient Sub-Groups**：在HCC和肝硬化亚组内，h-EV特有的PG形成显著蛋白质-蛋白质相互作用网络，富集于胞外外泌体、RNA结合和肝脏组织；而全囊泡特有的PG无显著功能富集。肝硬化h-EV富集铁死亡通路（与肝损伤相关），HCC h-EV富集癌症中心碳代谢通路。
**H-EV Isolation Reveals Disease-Associated Proteomic Signatures Between Clinical Phenotypes That Are Absent From Bulk EVs**：表型分辨的主成分分析显示，h-EV可将健康供体与肝病患者分离，而全囊泡不能。HCC与肝硬化比较中，PGD、H2AZ1/H2AZ2和PRDX5三个HCC预后标志物仅在h-EV中显著差异表达。健康→肝硬化→HCC的单调进展分析鉴定出CFB、PCSK9（联合插补）以及SERPINC1、A1BG、HMCN1（独立插补）等进展相关PG，且均不在全囊泡中达到显著。
**H-EV Preparations Retain Reduced miRNA Diversity but Richer Association to Disease-Specific Signals**：小RNA测序显示，过滤后h-EV仅有39个miRNA，而全囊泡有250个；但hsa-miR-124-3p（调控肝癌进展的miRNA）仅在h-EV中检出。HCC与肝硬化比较中，h-EV有5个显著上调miRNA（miR-22-3p、miR-23b-3p、miR-124-3p、miR-23a-3p、miR-221-3p），全囊泡有21个（其中15上调、6下调），两者无重叠。功能富集显示，仅h-EV的差异miRNA富集于HCC相关信号（糖酵解/糖异生、缺氧HIF激活、HGF/c-Met信号、Gq/Go信号及磷脂酰肌醇信号等），而全囊泡miRNA则富集于MAPK和TGF-β信号等更广泛的炎症反应。
讨论部分指出，NEXPLOR是迄今针对人血浆组织特异性EV富集策略的最全面验证，首次对ASGR1和ASGR2进行跨组织正交抗体验证，并新发现TFR2和SLCO1B1两个h-EV捕获标志物。TOP4捕获能主动排除大量造血细胞EV背景，从而恢复肝细胞特异性信号。相较于全囊泡，h-EV在蛋白质组深度、可重复性和疾病相关性方面均显著提升。研究局限包括捕获标志物因跨膜结构域和糖基化难以被质谱检测、无法绝对定量血浆TS-EV，以及疾病相关蛋白关联需在更大队列中验证。研究结论是：NEXPLOR为基础的h-EV捕获能够在蛋白质组和转录组层面实现高分辨标志物发现，恢复肝细胞选择性、疾病相关的生物学信息，这些信息在全囊泡的丰富蛋白和异质性囊泡背景中被掩盖。该策略具有可转移性，可适配任何组织来源，为数据驱动和AI驱动的生物标志物发现及精准医学提供了关键途径，并为HCC、肝硬化等亟需无创生物标志物的疾病提供了更具可操作性的液体活检方案。
