《Journal of Extracellular Vesicles》：Heparin Can Augment Extracellular Vesicle Yield by Inhibiting Reuptake in Donor Cells During Cell Propagation
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摘要：胞外囊泡（EVs）在发育、健康和疾病中介导细胞间通讯。肝素是人诱导多能干细胞（hiPSC）培养基中的常见组分，但其对hiPSC-EVs的影响除稳定生长因子外尚不清楚。已有证据表明，肝素以剂量依赖方式抑制异型靶细胞对EV的摄取。本研究探讨了肝素是否影响hi
摘要：胞外囊泡（EVs）在发育、健康和疾病中介导细胞间通讯。肝素是人诱导多能干细胞（hiPSC）培养基中的常见组分，但其对hiPSC-EVs的影响除稳定生长因子外尚不清楚。已有证据表明，肝素以剂量依赖方式抑制异型靶细胞对EV的摄取。本研究探讨了肝素是否影响hiPSC-EV的产量、储存、表型或功能。研究人员通过大规模hiPSC-EV扩增，在存在或不存在递增剂量肝素的条件下获得促血管生成的hiPSC-EVs，并测定了EV的数量、特性和功能性。肝素延迟了hiPSC集落融合，但未显著影响hiPSC的活力、多能性标志物和增殖。在200 IU肝素/mL条件下，四跨膜蛋白+/脂筏蛋白+ hiPSC-EV数量显著升高（平均367±31 EVs/细胞/24小时），使得能够以优于1010/mg的颗粒/蛋白质比高效纯化超过1011/mL的功能性EV。肝素以剂量依赖方式抑制hiPSC和内皮祖细胞对EV的摄取，效果与5 IU/mL黄杆菌肝素酶相当，并在NaCl而非细胞条件培养基中增加了储存后的EV回收率。在1% O2条件下，从含200 IU/mL肝素的hiPSC获得的EV维持了与无肝素对照组hiPSC-EVs相似的优越血管生成能力。研究得出结论，肝素抑制hiPSC-EV的再摄取并稳定NaCl冷冻保存的EV，从而在保持促血管生成功能的同时提高EV回收率。因此，尤其是在多能干细胞（PSC）培养基中，应记录肝素的存在及其剂量。
论文解读：肝素通过抑制再摄取提高胞外囊泡产量的机制与应用研究
一、研究背景与目的
胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一类由细胞释放的纳米级亚细胞结构，携带蛋白质、脂质和核酸等生物活性分子，在短距离和长距离细胞间通讯中发挥关键作用。EVs在血管生成、心血管疾病及癌症等多种生理病理过程中扮演重要角色，因而作为无细胞治疗产品展现出巨大的应用潜力。然而，如何高效、大规模地生产功能完整的EVs仍是该领域面临的主要挑战之一。
肝素作为一种常见的细胞培养基添加剂，已知能够稳定成纤维细胞生长因子2（FGF2）、防止多能干细胞（PSCs）自发分化，并在异型靶细胞中抑制EV摄取。尽管肝素在EV生产细胞的培养和功能实验中频繁使用，其对EV净产量、回收率及功能性的具体影响此前尚未得到系统研究。此外，现有文献中关于肝素剂量和EV定量报告的标准化严重不足，阻碍了研究结果的比较与重复。因此，本研究旨在系统评估肝素补充对人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSC）来源EV的产量、储存稳定性、表型特征及促血管生成功能的影响，并揭示其潜在机制。
二、主要技术方法
研究人员首先通过PubMed检索建立了包含202篇EV相关肝素研究的文献数据库，利用在线工具ev-zone.org进行系统性分析。实验部分采用三个独立的hiPSC克隆系（PMUi001-A、PMUi002-A、BIHi001-A）以及HEK293T CD63-mNeon工程细胞株作为模型。在低氧（1% O2）条件下，于培养基中添加不同剂量（0、2、20、200 IU/mL）的肝素进行细胞扩增和EV收集。EV富集与纯化采用300 kDa截留分子量的中空纤维切向流过滤（Tangential Flow Filtration, TFF）系统。EV定量与表征通过可调电阻脉冲感应（Tunable Resistive Pulse Sensing, TRPS）和单颗粒流式细胞术（Single-Particle Flow Cytometry, FCM）完成，并使用点印迹法检测四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、脂筏蛋白-1（flotillin-1）及内质网污染标志物钙联蛋白（calnexin）。EV摄取实验采用荧光标记EV结合流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜进行定量与定性分析。血管生成功能通过内皮集落形成祖细胞（Endothelial Colony Forming Progenitor Cells, ECFC）在基质胶上的网络形成实验进行评估。
三、主要研究结果
3.1 肝素相关EV研究文献缺乏剂量和颗粒定量信息
通过对2005年至2025年7月间180篇相关文献的系统分析发现，仅50.6%的报告了肝素浓度或剂量，仅15.6%报告了生物学活性单位（IU）。高达82.2%的研究未提供任何EV定量数据，仅1.7%按MISEV2023推荐报告了颗粒/蛋白质比。这表明该领域在方法论报告方面存在显著缺陷。
3.2 肝素以剂量依赖方式提高hiPSC-EV产量
在三个独立hiPSC克隆中，随着肝素剂量从2 IU/mL增至200 IU/mL，每细胞产生的EV颗粒数显著增加（最高达平均367±31 EVs/细胞/24小时）。肝素处理使hiPSC形成更致密、边界清晰的集落，但不影响细胞活力、增殖及多能性标志物（Tra-1-81、SSEA4）的表达。点印迹分析显示，200 IU/mL肝素组中CD63、CD81和脂筏蛋白-1的信号强度显著高于无肝素对照组。
3.3 肝素补充提高EV回收率
经TFF纯化后，200 IU/mL肝素组的EV颗粒浓度显著高于对照组，而可溶性因子（SolF）组分中颗粒浓度极低。两组EV的平均粒径分别为109 nm和103 nm，差异不显著。点印迹证实纯化EV中富含四跨膜蛋白和脂筏蛋白-1，且无钙联蛋白污染，符合MISEV2023鉴定标准。
3.4 肝素抑制内皮靶细胞对EV的摄取
利用HEK293T CD63-mNeON来源的荧光EV，通过共聚焦显微镜和流式细胞术证实，200 IU/mL肝素显著减少了ECFC对EV的内化。定量分析显示，三个不同供体的ECFC中，肝素以剂量依赖方式降低荧光信号强度，且在200 IU/mL时达到统计学显著性。
3.5 肝素或肝素酶通过抑制再摄取导致hiPSC-EV积累
使用Atto 647 NHS酯标记的hiPSC-EV进行自体再摄取实验发现，200 IU/mL肝素或5 IU/mL黄杆菌肝素酶处理均显著降低了hiPSC对自身EV的摄取。流式细胞术和免疫荧光定量分析一致表明，两种处理均导致细胞内荧光信号显著下降，证明阻断EV与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan Sulfate Proteoglycans, HSPGs）的结合可有效抑制再摄取，从而使EV在条件培养基中累积。
3.6 肝素补充提高EV储存回收率
将HEK CD63-mNeON EV在含或不含200 IU/mL肝素的NaCl/HEPES缓冲液中于不同温度（37°C、4°C、-20°C、-80°C）储存7天后，肝素组在所有温度下均显著提高了荧光阳性EV的回收率。但在HAT金标准缓冲液或细胞条件培养基（CCM）中，肝素未表现出额外稳定效应。进一步实验表明，肝素对新鲜收获CCM中EV产量的提升主要归因于培养期间的再摄取抑制，而非储存过程中的直接稳定作用。
3.7 肝素补充不影响hiPSC-EV的促血管生成功能
在ECFC血管网络形成实验中，来自200 IU/mL肝素处理的hiPSC-EV与无肝素对照EV同样能够有效诱导毛细血管样结构形成，其总管长度与优化促血管生成因子混合物相当，且显著优于可溶性因子组分。表明肝素处理不影响EV的促血管生成功能。
四、讨论与结论
本研究首次系统证明了肝素能够通过竞争性抑制EV与细胞表面HSPGs的结合来阻断hiPSC-EV的自体和同型旁分泌再摄取，从而导致EV在培养上清中累积，实现产量提升。同时，肝素在简单盐溶液中储存时还可提高EV回收率，但在高蛋白含量的复杂培养基或HAT缓冲液中无此效应，提示其稳定作用可能依赖于特定缓冲环境。
研究还揭示了当前EV-肝素文献在剂量报告和颗粒定量方面的严重不足，强烈建议未来研究统一使用国际单位（IU）报告肝素生物学活性，并遵循MISEV2023指南进行EV定量和纯度评估。
结论：肝素通过抑制hiPSC-EV再摄取并稳定NaCl冷冻保存的EV，从而在保持促血管生成功能的同时提高EV回收率。因此，尤其是在多能干细胞培养基中，应记录肝素的存在及其剂量。
