《Journal of Extracellular Vesicles》：M2 Macrophage-Derived Small Extracellular Vesicle miR-106a-Loaded QCG Hydrogel Targets the RNF128-LXR Pathway to Reprogram Chondrocyte Cholesterol Metabolism for Osteoarthritis Therapy
编辑推荐：
本研究针对骨关节炎（osteoarthritis，OA）中软骨细胞胆固醇稳态失调与细胞衰老共同促进软骨退变的问题，开发了一种炎症响应型可注射QCG水凝胶，用于局部递送富含miR-106a的M2巨噬细胞来源小细胞外囊泡（small extracellular v
本研究针对骨关节炎（osteoarthritis，OA）中软骨细胞胆固醇稳态失调与细胞衰老共同促进软骨退变的问题，开发了一种炎症响应型可注射QCG水凝胶，用于局部递送富含miR-106a的M2巨噬细胞来源小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）。QCG水凝胶由季铵化壳聚糖（quaternized chitosan，QCS）与4-羧基苯硼酸-明胶（4-carboxyphenylboronic acid-gelatin，CPBA-gelatin）构建，并负载miR-106a富集的M2-sEVs（QCG@sEV-miR-106a）。研究人员通过差速超速离心分离M2-sEVs，并采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）及囊泡相关蛋白标志物对其进行表征。高通量miRNA谱分析及软骨细胞RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）鉴定miR-106a为候选调控分子，双荧光素酶报告基因实验证实RNF128为其直接靶点。功能实验表明，miR-106a抑制RNF128，从而促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成，同时减弱细胞衰老。探索性蛋白质组学筛查提示RNF128相关变化涉及胆固醇及溶酶体相关过程，而独立的分子与功能实验证明，RNF128促进LXRα泛素化及蛋白酶体依赖性降解，抑制LXR信号通路，并破坏胆固醇稳态。在内侧半月板失稳（destabilization of the medial meniscus，DMM）诱导的OA大鼠模型中，QCG@sEV-miR-106a表现出活性氧（reactive oxygen species，ROS）响应性释放、关节腔内滞留时间延长至22天、软骨退变和基质丢失减少、疼痛相关行为改善以及良好的短期生物相容性。综上所述，这些发现支持一种局部生物材料递送策略，即通过miR-106a介导的RNF128抑制来维持LXR信号通路和胆固醇稳态，从而减轻OA相关软骨细胞衰老。
论文解读
一、研究背景与意义
骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变、软骨下骨重塑、滑膜炎症和疼痛为特征的慢性退行性关节疾病。随着全球老龄化进程加速，OA的患病率持续上升，已成为中老年人群残疾的主要原因之一，给患者生活质量和社会经济造成沉重负担。目前临床治疗手段主要包括非甾体抗炎药、关节腔内注射透明质酸或糖皮质激素以及手术关节置换等，但这些方法均无法阻止软骨退变进程，长期使用还存在不良反应风险。缺乏能够延缓或逆转疾病进展的疾病修饰性OA药物（disease-modifying OA drug，DMOAD）是当前治疗的主要瓶颈。
软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其功能障碍和衰老被认为是OA发生和发展的关键驱动因素。衰老软骨细胞表现出细胞周期阻滞、衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）因子分泌增加以及细胞外基质合成减少，从而形成促进炎症和基质降解的自我延续循环。近年研究揭示，胆固醇稳态失调可加速软骨细胞衰老和OA病理进程。环指蛋白128（ring finger protein 128，RNF128），又称GRAIL，是一种E3泛素连接酶，可促进LXRα的泛素化和降解，降低其稳定性并损害胆固醇代谢调控。肝X受体（liver X receptor，LXR）是胆固醇稳态的主转录因子，在维持膜完整性、能量代谢和抗炎反应中发挥关键作用。因此，靶向调控RNF128-LXR通路以恢复胆固醇稳态，有望成为延缓OA进展的新策略。
小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）是直径约30–150 nm的纳米级膜囊泡，富含蛋白质、脂质和核酸，能够介导细胞间通讯，具有低免疫原性和优良生物相容性，已被广泛探索作为药物递送载体。M2巨噬细胞来源的sEVs具有抗炎特性和促进组织修复的能力，是miRNA递送的理想载体。miR-106a在调控细胞增殖、衰老和代谢中发挥重要作用，有望通过负调控RNF128来改善软骨细胞胆固醇稳态。然而，此前尚无研究报道利用M2巨噬细胞来源sEVs递送miR-106a靶向RNF128-LXR通路以延缓OA进展。此外，炎症响应型水凝胶能够感知病变部位的活性氧（reactive oxygen species，ROS）等病理信号，实现按需药物释放，从而提高局部药物浓度并减少全身副作用。基于QCS和CPBA-gelatin构建的QCG水凝胶具有ROS响应性和可注射性，能够在炎症环境中加速药物释放并延长关节腔内滞留时间。
本研究旨在开发一种负载M2巨噬细胞来源sEV-miR-106a的炎症响应型可注射QCG水凝胶（QCG@sEV-miR-106a），靶向RNF128-LXR通路，重编程软骨细胞胆固醇代谢，延缓细胞衰老并改善OA病理。该研究首次系统证明了RNF128-LXR通路在调控软骨细胞胆固醇稳态和衰老中的作用，并支持基于炎症响应型水凝胶的sEV介导miRNA递送策略，为早期OA干预和疾病修饰治疗提供了理论和转化医学支持。
二、关键技术方法
研究人员采用差速超速离心从大鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）中分离M2-sEVs，并通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白标志物进行表征。利用Illumina HiSeq 4000平台对M1/M2巨噬细胞来源sEVs及正常/IL-1β刺激的软骨细胞进行miRNA和mRNA测序，结合TargetScan、miRDB和mirDIP数据库预测miR-106a靶基因，并通过双荧光素酶报告基因实验验证。采用TMT标记定量蛋白质组学分析RNF128过表达软骨细胞的差异蛋白。通过电穿孔法制备sEV-miR-106a，并构建由QCS和CPBA-gelatin组成的ROS响应型QCG水凝胶。在DMM诱导的SD大鼠OA模型中评估治疗效果，采用IVIS成像、组织学染色、OARSI评分、von Frey测试和CatWalk步态分析等手段。
三、研究结果
3.1 M2-Exo miRNA谱分析及miR-106a靶基因预测
研究人员对M1/M2巨噬细胞来源sEVs及正常/IL-1β刺激软骨细胞进行高通量测序，交集分析鉴定出miR-106a在M2-Exo中上调而在IL-1β刺激软骨细胞中下调，RT-qPCR验证了测序结果。靶基因预测与GO/KEGG富集分析显示候选靶基因主要与细胞衰老通路相关。将预测靶基因与IL-1β上调基因取交集，唯一重叠基因为RNF128，且RT-qPCR和Western blot证实IL-1β组RNF128表达显著升高。双荧光素酶报告基因实验证实miR-106a直接靶向RNF128 3′UTR。
3.2 M2巨噬细胞来源sEV-miR-106a促进软骨细胞增殖和基质合成并减弱衰老
在IL-1β刺激的软骨细胞中，M2-Exo处理显著提高细胞活力和增殖能力，增加COL2和ACAN表达，降低MMP13表达，并减少衰老标志物p16、p21表达和SA-β-Gal阳性细胞比例。miR-106a抑制剂部分逆转了这些保护效应，证明miR-106a是M2-Exo介导软骨保护的关键分子。
3.3 囊泡介导miR-106a递送的优势
直接比较实验显示，ExomiR-106a比剂量匹配的游离miR-106a mimic产生更持久和更高水平的细胞内miR-106a，并在促进增殖、改善基质蛋白谱和降低衰老负担方面效果最强，支持囊泡介导递送的优势。
3.4 miR-106a通过靶向RNF128减轻软骨细胞衰老
在miR-106a mimic联合RNF128过表达的挽救实验中，RNF128过表达恢复了miR-106a抑制的RNF128表达，并逆转了miR-106a促进增殖、增强基质合成和抑制衰老的作用，证实RNF128是miR-106a的关键功能靶点。
3.5 探索性蛋白质组学鉴定RNF128相关胆固醇和溶酶体过程变化
对oe-NC和oe-RNF128软骨细胞进行TMT蛋白质组学分析，鉴定出128个候选差异蛋白。探索性GO/KEGG分析提示胆固醇稳态、溶酶体、内体和脂质相关过程富集。靶向Western blot验证显示RNF128过表达降低LXRα、ABCA1和SREBP-1c蛋白水平，Filipin染色和胆固醇定量显示细胞内胆固醇积累增加。
3.6 RNF128通过诱导LXRα泛素化介导降解促进软骨细胞衰老
RNF128敲低增加LXRα蛋白水平，过表达则降低LXRα蛋白水平，但mRNA水平不变，表明RNF128在转录后水平调控LXRα。Co-IP实验证明RNF128促进LXRα泛素化，MG132处理部分恢复LXRα蛋白丰度，E3连接酶活性缺陷突变体和RING结构域缺失突变体均不能有效诱导LXRα泛素化。CHX追踪实验显示RNF128过表达加速LXRα降解。LXR激动剂GW3965处理逆转了RNF128过表达诱导的衰老标志物升高和衰老细胞比例增加。
3.7 M2-sEV-miR-106a通过激活LXR-胆固醇代谢通路减轻软骨细胞衰老
M2-Exo处理上调miR-106a、LXRα、ABCA1和SREBP-1c表达，降低溶酶体胆固醇积累和总胆固醇水平，并减少衰老标志物表达。LXR拮抗剂GSK2033和SR9238有效抑制了M2-Exo诱导的LXR通路激活，并逆转了其抗衰老效应，证明LXR激活在sEV-miR-106a抗衰老功能中的关键作用。
3.8 QCG水凝胶的表征与性质
研究人员合成了QCS和CPBA-gelatin，通过1H NMR和FTIR确认结构。SEM显示QCG水凝胶具有均匀多孔网络结构，QCS含量增加导致孔径减小。所有QCG水凝胶在数秒内完成凝胶化，QCG3约5秒完全凝胶化。流变学测试显示所有水凝胶的储能模量大于损耗模量，压缩模量随QCS含量增加而升高。体外和体内降解实验显示40天后降解率达85%–99%，30天后体内降解超过80%。
3.9 QCG水凝胶的可注射性、自愈合和组织粘附性
QCG水凝胶可通过注射器针头挤出形成"QCG"字样而不堵塞针头，可模塑成不规则形状，并表现出优异的自愈合能力。猪皮剪切测试显示QCG3具有最强的粘附强度，归因于QCS增强氢键作用和动态共价硼酸酯键。
3.10 ROS响应型QCG@sEV-miR-106a水凝胶的构建与性质
QCG水凝胶利用ROS敏感的硼酸酯键作为交联位点，在H2O2存在下降解加速，QCG3在第10天表现出最小残余体积和最高ROS响应降解率。DPPH和PTIO自由基清除实验显示QCG3分别达到约95%和70%的清除率。sEV-miR-106a负载后保持典型杯状形态，PKH26标记显示其在凝胶中均匀分布。在氧化环境下sEV-miR-106a累计释放超过80%，而PBS中释放更缓慢持续。共培养实验证实软骨细胞可有效摄取水凝胶释放的sEVs。
3.11 QCG@sEV-miR-106a水凝胶的体外生物相容性
CCK-8实验显示QCG和QCG@sEV-miR-106a处理组与大鼠原代软骨细胞和人C28/I2软骨细胞共培养1、3、5天后细胞活力无显著差异，Calcein-AM/PI染色几乎未见细胞死亡，溶血率低于1%，表明水凝胶具有优良的生物相容性和生物安全性。
3.12 QCG@sEV-miR-106a水凝胶的抗氧化和抗衰老效应
在H2O2诱导的氧化应激模型中，QCG部分改善MDA、GSH和CAT水平，QCG@sEV-na?ve提供进一步改善，QCG@sEV-miR-106a产生最大程度的整体正常化。DHE和DCFH荧光显示氧化敏感信号呈梯度降低。p16、p21表达和SA-β-Gal阳性率在QCG@sEV-miR-106a组最低，MitoSOX、8-OHdG和蛋白羰基测量显示该组氧化损伤负担最低。
3.13 QCG@sEV-miR-106a水凝胶的体内滞留及其在DMM诱导OA模型中的治疗效果
IVIS成像显示QCG@sEV-miR-106a组荧光信号持续至第22天，而游离sEV-miR-106a组第5天后几乎检测不到信号，证明水凝胶显著延长关节腔内滞留时间。在DMM诱导的OA大鼠模型中，QCG@sEV-miR-106a治疗显著减轻关节肿胀和软骨破坏，恢复软骨细胞数量和蛋白聚糖水平，降低OARSI评分，增加软骨厚度。分子水平上，QCG@sEV-miR-106a恢复miR-106a和LXRα表达，降低RNF128表达，减少软骨胆固醇积累，恢复COL2和ACAN表达并抑制MMP13。von Frey测试和CatWalk步态分析显示QCG@sEV-miR-106a显著提高缩爪阈值、增加后爪印面积和最大接触面积，表明疼痛相关行为改善。主要器官H&E染色未见病理改变，ALT、AST、Cr和BUN水平无显著变化，证实短期生物相容性良好。
四、结论
本研究开发了一种炎症响应型可注射QCG水凝胶负载M2巨噬细胞来源sEV-miR-106a（QCG@sEV-miR-106a），用于OA治疗。研究证实miR-106a通过直接靶向RNF128，抑制其E3泛素连接酶活性介导的LXRα泛素化降解，从而维持LXR信号通路和胆固醇稳态，减轻软骨细胞衰老。QCG水凝胶具有ROS响应性释放、延长关节腔内滞留、良好生物相容性和生物安全性等特性，在DMM诱导的OA大鼠模型中显著减轻软骨退变、改善疼痛相关行为。该研究首次系统阐明了RNF128-LXR通路在调控软骨细胞胆固醇稳态和衰老中的作用，为基于炎症响应型水凝胶的sEV介导miRNA递送策略提供了科学依据，为早期OA干预和疾病修饰治疗提供了有前景的候选方案。
