细胞完整性保留减少杂质释放并实现肺炎链球菌高纯度荚膜多糖生产

《Materials Today Advances》：Cell integrity preservation reduces impurity release and enables high-purity capsular polysaccharide production in Streptococcus pneumoniae

　　

目的：肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是全球肺炎、脑膜炎、败血症和中耳炎的主要病原体。其荚膜多糖（capsular polysaccharide, CPS）是主要毒力决定因素，也是肺炎球菌疫苗的关键抗原。大规模CPS生产需要高度纯化的产品且杂质含量极低，尤其是细胞壁多糖（cell wall polysaccharide, CWPS）。然而，常规脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate, DOC）诱导的自溶会破坏细胞完整性，并释放大量CWPS及其他细胞污染物，从而增加下游纯化的复杂性。

方法：研究人员开发了一种集成生产策略，将优化发酵与非裂解灭活相结合，以从源头保持细胞完整性并抑制杂质释放。采用电子显微镜评估灭活后的细胞形态。基于上述上游控制，建立了一种简化的下游纯化工艺，包括超滤、单步氯化钙辅助酸沉淀和渗滤，用于CPS纯化。

结果：该策略在七种肺炎球菌血清型（1、4、5、18C、19A、22F和33F）中进行了评估。非裂解灭活保持了细胞形态，并显著减少了细胞相关杂质的释放。所得CPS制剂杂质水平显著降低，尤其是CWPS，同时保持结构完整性，并符合欧洲药典（第11版）的相关规格。

结论：这些发现表明，在源头控制杂质产生可显著降低肺炎球菌CPS生产中下游纯化的负担。所提出的机制驱动策略为生产高纯度CPS提供了实用且可放大的框架，并支持开发日益多价的肺炎球菌多糖和结合疫苗。

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起肺炎、脑膜炎、菌血症和中耳炎的主要病原体，尤其威胁5岁以下儿童和65岁以上老年人。随着耐药菌株增多，疫苗接种在疾病预防中的地位日益重要。荚膜多糖（capsular polysaccharide, CPS）是该菌最外层的主要毒力决定因子，具有抗吞噬作用，同时也是肺炎球菌疫苗的关键抗原成分。然而，疫苗用CPS必须严格控制杂质，尤其是细胞壁多糖（cell wall polysaccharide, CWPS）。CWPS是一种带负电、结构保守的聚合物，虽然具有免疫原性，但诱导的是非保护性抗体，并可能引发炎症反应；残留CWPS还会与CPS竞争免疫识别和结合位点，降低CPS特异性IgG和调理吞噬活性。因此，控制CWPS含量极低（如≤3%）被认为是提高下一代疫苗功能免疫原性的前瞻性策略。但CWPS与CPS结构相似且紧密相关，去除非常困难，尤其对血清型1、4、5、18C、19A、22F和33F而言。传统制造中，发酵末期加入脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate, DOC）诱导菌体自溶并灭活，虽然能释放CPS，但同时释放大量肽聚糖片段、CWPS、蛋白质、核酸等杂质，使下游纯化步骤繁琐、成本高昂。色谱、酶解等方法各有局限，且CPS含有丙酮酸、O-乙酰基、磷酸二酯等敏感结构，纯化条件必须温和。因此，从源头抑制杂质释放，而非仅依赖下游去除，具有重要意义。

针对上述问题，研究人员开发了一种集成的发酵-灭活-纯化平台。该平台的核心是在发酵后期通过气体切换促进CPS释放，然后采用非裂解灭活剂β-丙内酯（β-propiolactone, BPL）或甲醛替代DOC，保持细菌细胞完整，从而将CWPS及其他细胞相关杂质限制在细胞内，实现“源头控制”。下游仅需超滤/渗滤、单步氯化钙辅助酸沉淀和最终超滤，即可获得高纯度CPS。研究人员对七种血清型（1、4、5、18C、19A、22F、33F）进行了系统验证，所得产品符合欧洲药典（第11版）标准，同时保留结构完整性。这一机制驱动的策略显著简化了下游工艺，为多价肺炎球菌多糖和结合疫苗的生产提供了可放大的框架。

在技术方法方面，研究人员使用的菌株来源于国家医学菌种保藏中心（CMCC）参考菌株，并经过中国食品药品检定研究院（NIFDC）检定。发酵在15 L生物反应器中进行，采用补料分批模式，控制温度36℃、pH 7.2、转速90 rpm，前期通入100% CO₂，待培养至对数后期（约最大OD₆₀₀的80%）时切换为无菌空气以刺激CPS释放。灭活采用0.1% DOC、0.1% BPL或1%甲醛三种方式处理40分钟，并于4℃放置12小时，无菌检验合格。通过透射电子显微镜评价灭活后细胞形态。下游纯化流程为：离心和微滤去除菌体及颗粒；100 kDa超滤膜浓缩和渗滤去除小分子杂质；加入CaCl₂至150 mM并用磷酸调pH至3.0，利用原位生成的磷酸钙纳米粒子吸附并絮凝蛋白质和核酸；离心取上清中和后再次超滤浓缩，冻干获得纯化CPS。产品质量按照欧洲药典方法检测蛋白质、核酸、总氮、磷、分子大小分布、糖组成（糖醛酸、己糖胺、甲基戊糖）及O-乙酰基等指标；分子量通过尺寸排阻色谱-多角度光散射-示差折光（SEC-MALS-RI）测定；结构鉴定和CWPS定量采用¹H NMR。

研究结果如下：

3.1 灭活过程对细菌形态的影响：透射电镜显示，BPL和甲醛处理后的多种血清型细菌均保持完整细胞形态，而DOC处理导致细胞广泛破裂。完整细胞壁作为天然物理屏障，将CWPS等杂质保留在细胞内，验证了在自溶发生前收获和灭活的“黄金窗口”策略。该结果从形态学层面证实了非裂解灭活的合理性。

3.2 纯化天然CPS的质量：对七种血清型纯化CPS按照欧洲药典分析发现，与DOC灭活相比，BPL灭活的粗CPS产量降低约19%–26%，甲醛灭活降低约37%–52%；但纯化后蛋白残留显著下降（如血清型4、5、18C、33F），核酸等杂质也略有降低，所有指标均远低于药典限度。BPL与甲醛处理的杂质谱差异不大。其余关键质量属性（总氮、磷、分子大小、糖组成、O-乙酰基等）不受工艺改变影响，符合药典标准。这表明新工艺能在不损失产品质量的前提下大幅降低杂质。

3.3 纯化CPS的¹H NMR谱：通过¹H NMR分析，七种CPS的异头氢化学位移等特征信号与文献报道一致，确认重复单元主链、支链和关键基团完整。血清型18C和22F在70℃下额外测定，避免了HDO信号干扰。部分血清型观察到O-乙酰基或N-乙酰基特征峰。利用磷酰胆碱甲基信号（δH 3.24）与CPS特征峰积分比计算CWPS摩尔含量：传统DOC法制备的CPS中CWPS摩尔百分比在1.2%–6.7%之间，而BPL和甲醛法均低于3%，进一步证实非裂解灭活显著减少了磷酰胆碱相关杂质。

在讨论部分，研究人员指出，肺炎链球菌的磷壁酸包括壁磷壁酸（wall teichoic acid, WTA）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid, LTA），分别锚定于肽聚糖和细胞膜；DOC诱导的自溶使细胞完整性破坏，导致CWPS和磷壁酸相关杂质大量释放。非裂解灭活从源头抑制这些杂质的产生，符合质量源于设计（Quality by Design, QbD）的“预防先于产生”理念。同时，残留CWPS过多可能占据后续结合疫苗生产中的反应位点，降低结合效率和抗原特异性免疫应答。该策略在七种血清型中均展现出稳健性和可重复性，且所用微滤、超滤/渗滤、酸沉淀均为成熟可放大的单元操作，尽管仍需在GMP条件下进一步验证，但已具备工业转化潜力。

研究结论（翻译）：CPS是肺炎球菌疫苗的主要抗原成分，必须满足严格质量标准。传统DOC灭活会破坏细胞完整性并释放大量CWPS等杂质，使下游纯化复杂。本研究开发了源头控制杂质的工艺强化策略：先厌氧培养，指数后期调节气体环境增强CPS释放，再用BPL或甲醛非裂解灭活保持细胞完整，然后通过简化流程（超滤、单步氯化钙辅助酸沉淀、最终超滤/渗滤）获得纯化CPS。该策略在七种血清型中成功制备符合欧洲药典（第11版）规格的高纯度CPS，杂质水平显著降低（尤其CWPS），结构完整性经NMR确认。虽然非裂解灭活使粗CPS回收率适度降低，但可通过优化发酵条件补偿；更重要的是，它减少了单元操作和下游成本，因此应从上下游整体效率评估工艺性能。随着肺炎球菌疫苗向更高价型发展，源头杂质控制将更加重要。该策略为新一代多糖和结合疫苗的工业生产提供了实用平台。