巨噬细胞靶向纳米颗粒复合骨支架用于局部持续抗结核药物递送并保留成骨性能的研究

《Materials & Design》：Construction of a macrophage-targeted nanoparticle-integrated bioactive composite scaffold preserving osteogenic capacity for sustained local antitubercular drug delivery

　　

： 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种主要寄居于巨噬细胞内的需氧胞内杆菌，是结核病的主要病原体。骨关节结核因其独特的病理特征和现有疗法的局限性，仍是重大临床挑战。本研究设计了一种兼具抗菌与成骨功能的巨噬细胞靶向缓释系统。研究人员选取利福喷汀（rifapentine，RPT）作为抗结核模型药物，将其封装于聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇（poly(lactic-co-glycolic acid)-polyethylene glycol，PLGA-PEG）纳米颗粒中，并通过甘露糖胺（mannosamine）对颗粒表面进行功能化修饰，以利用巨噬细胞的甘露糖受体介导摄取机制。该纳米颗粒通过超声乳化法制备，随后被负载到羟基磷灰石/β-磷酸三钙（hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate，HA/β-TCP）生物陶瓷支架上，形成复合平台。研究人员对该多功能复合体的巨噬细胞靶向效率、抗菌活性及体外成骨潜能进行了系统评估，并在大鼠股骨缺损模型中进一步验证了其促进骨再生和局部药物富集的能力。该策略旨在通过整合靶向化疗与支架介导的骨修复，提高病灶内药物浓度、降低全身毒性及复发风险，最终为骨关节结核的综合治疗提供新的途径。

论文解读

研究背景

结核病是由主要寄居于巨噬细胞内的结核分枝杆菌引起的严重传染病。骨关节结核因病灶常伴有干酪样坏死和钙化肉芽肿，血管化严重受损，形成硬化无血供的环境，导致常规全身化疗难以在局部达到有效药物浓度，患者往往需要接受长达9至12个月甚至更久的高剂量多药联合方案，伴随显著的肝毒性和神经毒性等副作用，患者依从性差，易导致治疗中断、疾病复发和耐药风险增加。因此，迫切需要开发如靶向药物递送和骨组织工程等创新策略，以提高局部药物的生物利用度并减少全身副作用。利福喷汀作为一种半合成环戊基利福霉素，活性是利福平的2至10倍，半衰期更长，但传统给药方式仍难以在巨噬细胞内达到足够杀菌浓度。将药物封装于可降解聚合物纳米颗粒中，特别是经甘露糖胺修饰以实现巨噬细胞靶向，并结合具有骨传导性的双相磷酸钙支架，有望同时解决药物局部递送和骨缺损修复两大难题。

研究方法与技术

研究人员采用的关键技术方法包括：通过超声乳化法将利福喷汀封装于经甘露糖胺修饰的PLGA-PEG聚合物中制备靶向纳米颗粒；利用3D打印直写挤出成型技术制备羟基磷灰石/β-磷酸三钙多孔生物陶瓷支架；通过静电吸附将纳米颗粒负载于支架上获得复合支架；运用动态光散射、透射电镜、傅里叶变换红外光谱、X射线光电子能谱、热重分析等方法表征纳米颗粒理化性质；通过扫描电镜、微计算机断层扫描、力学测试等手段表征支架结构；采用高效液相色谱法测定包封率、载药量及体外释放曲线；利用共聚焦显微镜和流式细胞术评估巨噬细胞对纳米颗粒的摄取效率；通过微量肉汤稀释法和菌落计数法评价体外及胞内抗结核活性；采用蛋白质印迹法检测PI3K/Akt/mTOR通路及自噬标志蛋白表达；通过茜素红S染色、碱性磷酸酶染色、实时定量PCR及蛋白质印迹法评估骨髓间充质干细胞成骨分化；建立大鼠股骨缺损模型进行体内骨再生和药物浓度评价。

研究结果

1. 1.
   Physicochemical Characterization：四种纳米颗粒均呈均匀分散的球形核壳结构。红外光谱和X射线光电子能谱证实了甘露糖胺成功通过酰胺键偶联至PLGA-PEG。热重分析显示偶联后材料热稳定性增强。RPT@Man-PLGA-PEG纳米颗粒平均粒径为108.5±7.6 nm，多分散指数为0.189±0.019，Zeta电位为负值。包封率为81.6±5.3%，载药量为13.6±0.9%。复合支架总载药量为0.41±0.07 mg/支架，负载效率达97.2±3.1%。
2. 2.
   In vitro Cytotoxicity Assay：载药纳米颗粒对RAW264.7巨噬细胞和大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）的细胞活力均保持在80%以上，而游离利福喷汀在50 μg/mL浓度下显著降低细胞活力。空白纳米颗粒在0.6 mg/mL浓度下细胞活力超过90%。复合支架浸提液对rBMSCs活力无不良影响。
3. 3.
   Cellular uptake of macrophage-targeted nanoparticles in vitro：共聚焦显微镜显示，经甘露糖胺修饰的纳米颗粒在巨噬细胞内呈现强绿色荧光信号，而未修饰的PLGA-PEG纳米颗粒荧光信号极弱。流式细胞术定量分析表明，Man-PLGA-PEG纳米颗粒的细胞摄取量在24小时内始终高于未修饰组约4倍，且游离甘露糖胺预孵育可显著抑制其摄取，证实该过程部分由甘露糖受体介导。
4. 4.
   Evaluation of in vitro and intracellular inhibition of Mycobacterium tuberculosis：RPT@Man-PLGA-PEG纳米颗粒对结核分枝杆菌H37Rv的最低抑菌浓度为0.047 μg/mL，显著低于游离利福喷汀的0.2 μg/mL。在胞内抑菌实验中，两种载药纳米颗粒均比游离药物更有效地减少了巨噬细胞内活菌数量，差异具有统计学意义。
5. 5.
   RPT@Man-PLGA-PEG induces autophagy via modulation of the PI3K/Akt/mTOR pathway：H37Rv感染显著上调了巨噬细胞中PI3K、Akt和mTOR的磷酸化水平。RPT@Man-PLGA-PEG处理组显著抑制了这些蛋白的磷酸化，效果优于游离RPT和RPT@PLGA-PEG组。同时，该处理组增强了LC3-II积累并促进了P62清除，表明恢复了自噬活性。
6. 6.
   Composite scaffold characterization：HA/β-TCP支架具有高度多孔且相互连通的结构，孔隙率为45.76±3.72%，孔径为350±21 μm。负载纳米颗粒后孔隙率无显著变化，但抗压强度从2.3±0.3 MPa提升至3.4±0.4 MPa。X射线衍射确认了双相磷酸钙的晶体纯度，负载纳米颗粒后晶型未改变。
7. 7.
   In vitro release profile of RPT@Man-PLGA-PEG@HA/β-TCP：复合支架在模拟生理条件下表现出稳定持续的释放特性，前24小时释放约24.73%，随后在312小时内缓慢持续释放，无明显突释现象。
8. 8.
   Immunophenotypic and differentiation-based identification of rBMSCs：分离的rBMSCs呈典型纺锤形，高表达CD29和CD90，低表达CD45和CD11b/c，并具有成骨和成脂分化潜能。
9. 9.
   Scanning Electron Microscopy (SEM) Imaging：rBMSCs在HA/β-TCP和复合支架表面均良好粘附和铺展，细胞伸出伪足紧密锚定于支架表面。
10. 10.
    Cell morphology：骨架染色显示，与HA/β-TCP或复合支架浸提液共培养的rBMSCs肌动蛋白束排列清晰有序，细胞骨架完整性良好。
11. 11.
    Effects of composite scaffolds on rBMSC migration：划痕实验和Transwell迁移实验均表明，HA/β-TCP和复合支架组显著促进了rBMSCs的迁移能力。
12. 12.
    Assessment of Osteogenic Differentiation by Alizarin Red S and ALP Staining：HA/β-TCP支架组显示出强烈的碱性磷酸酶活性和显著的钙沉积，而对照组仅有微弱阳性染色。
13. 13.
    Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)：HA/β-TCP和复合支架组中成骨标志基因CoL-1、Spp1（OPN）、Bglap（OCN）和Sp7（OSX）的表达水平显著上调。
14. 14.
    Western blot analysis：HA/β-TCP和复合支架组成骨相关蛋白OCN、CoL-1、Osx和OPN的表达水平明显升高。
15. 15.
    In vivo experiments：在大鼠股骨缺损模型中，Micro-CT分析显示复合支架组在6周和12周时的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量和厚度均显著优于空白缺损组。药物浓度测定表明，复合支架组在术后1、3、7和14天骨组织中利福喷汀浓度均显著高于直接将游离药物负载于支架的对照组。组织学染色（Von Kossa、亚甲基蓝-酸性品红、Goldner三色、Van Gieson染色）证实复合支架组新生骨矿化良好、胶原排列有序。心、肝、肾、肺、脾的组织切片和血液生化指标未见明显毒性反应。

总结讨论与研究结论

本研究成功构建了一种兼具巨噬细胞靶向药物递送和骨再生功能的复合支架系统。该系统的核心优势在于：甘露糖胺修饰使纳米颗粒能够高效靶向并进入巨噬细胞，不仅提高了胞内药物浓度以杀灭结核分枝杆菌，还能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路恢复被病原体阻断的自噬功能，从而协同增强抗菌效果。同时，HA/β-TCP双相磷酸钙支架不仅提供了优异的骨传导性和力学支撑，还作为局部药物储库实现了长达14天的持续药物释放，避免了全身给药的毒副作用。体内实验进一步证实，该复合支架能有效促进骨缺损修复，并在局部维持较高药物浓度。因此，这种整合了靶向化疗与骨组织工程的策略，为骨关节结核的综合治疗提供了一种安全有效的全新方案，有望显著改善患者的预后和生活质量。