《Modern Pathology》：Ex vivo fluorescence confocal microscopy for real-time margin assessment of nonmelanoma skin cancer in Mohs surgery: A prospective interventional study
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新一代活体荧光共聚焦显微镜（ex vivo fluorescence confocal microscopy, EVFCM）可生成与常规组织病理学直接可比的苏木精-伊红样图像。其在非黑素瘤皮肤癌（non-melanoma skin cancer, NMSC）显
新一代活体荧光共聚焦显微镜（ex vivo fluorescence confocal microscopy, EVFCM）可生成与常规组织病理学直接可比的苏木精-伊红样图像。其在非黑素瘤皮肤癌（non-melanoma skin cancer, NMSC）显微描记手术中采用新型采集模式的观察者间表现仍有待明确。本前瞻性干预研究纳入2025年1月至10月期间接受Mohs手术的39例患者的42个肿瘤，采用EVFCM进行检查。标本经正交切片、染色，并以数字染色模式采集。由一名皮肤科医生和一名病理科医生独立、盲法审查外周及深部切缘，二者均接受过EVFCM图像判读培训。一致阴性切缘视为无肿瘤，而阳性、不一致或不确定发现则触发再次切除与重新评估。采用Cohen’s κ统计量评估与组织病理学的诊断一致性。共评估261个切缘。皮肤科医生与病理科医生在切缘评估（κ=0.863；SE 0.067；p<0.001；观察一致性98.6%）和组织学类型评估（κ=0.882；SE 0.031；p<0.001；观察一致性97.6%）方面均达到几乎完全一致。与组织病理学相比，EVFCM表现出高性能，总体诊断准确率为96.4%。联合评估的AUC为0.875（SE 0.074；95% CI 0.730-1.000）。EVFCM与组织病理学之间仅观察到两处不一致：一处为假阴性切缘评估，另一处归因于样本处理差异。上述发现支持EVFCM作为NMSC术中切缘评估的可靠工具。皮肤科医生与病理科医生判读表现相当，支持其整合入Mohs手术工作流程的潜力；然而，标准化样本处理方法可能带来的工作流程优势需采用定量时间指标进行前瞻性验证。
研究背景与目的
非黑素瘤皮肤癌（non-melanoma skin cancer, NMSC）是皮肤科最常见的恶性肿瘤类型，其中基底细胞癌（basal cell carcinoma, BCC）和鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）占据绝大多数。对于侵袭性、复发性或边界不清的高危NMSC，尤其当病灶位于功能或美容敏感区域时，显微描记手术（包括Mohs手术）是关键的根治性治疗手段。Mohs手术的核心在于术中逐层切除并即时评估手术切缘状态，以确保肿瘤完全切除的同时最大限度保留正常组织。传统术中切缘评估依赖冰冻切片或常规组织病理学，但上述方法耗时较长，且冰冻切片存在组织变形、染色质量不稳定等局限性。近年来，活体荧光共聚焦显微镜（ex vivo fluorescence confocal microscopy, EVFCM）作为一种新兴的光学成像技术被引入皮肤科，可直接对新鲜切除标本进行术中切缘评估，有望成为冰冻切片或常规组织病理学的快速替代方案。新一代EVFCM系统（Vivascope 2500M-G4?）可将灰度反射马赛克图像与绿色荧光马赛克图像融合，生成苏木精-伊红样（hematoxylin-eosin-like）图像，从而与常规组织病理学直接比对。既往研究虽已初步证实EVFCM在BCC切缘评估中的可行性，但多数采用早期灰度系统，且观察者间诊断性能、不同专业背景判读者的可比性，以及新型数字染色模式在NMSC中的应用价值仍有待系统验证。为此，研究人员设计并实施了一项前瞻性干预研究，旨在评估新一代融合模式EVFCM在NMSC Mohs手术中的诊断准确性及切缘评估性能，并比较皮肤科医生与病理科医生作为判读者的诊断一致性。
研究设计与方法
本研究为单中心、干预性研究，于意大利雷焦艾米利亚Arcispedale Santa Maria Nuova医院皮肤癌中心开展，研究周期为2025年1月至10月。研究纳入标准包括：病灶位于美学敏感区域、存在毁容风险或需复杂重建手术；临床及皮肤镜检查边界模糊；根据皮肤镜标准判定为高危肿瘤。共纳入39例患者的42个肿瘤。标本处理采用标准化流程：手术切缘在距临床及/或健康皮损周围皮肤约2 mm处标记，采用经典Mohs技术切除病灶，并以参考缝线即时定向。标本沿周缘以约1 mm间隔进行正交垂直切割，分为四个外周切缘，中央部分经正中垂直切割一分为二，共获得五个切片（对应术前定义的A-D外周切缘及中央E切缘）。切片经70%乙醇处理30秒以去除表面脂质并促进染料渗透，随后以吖啶橙（Acridine Orange, 1.3 mM）和快绿FCF（Fast Green FCF, 0.6 mM）染色，并以生理盐水冲洗。中央部分单独装片，外周切缘则共同装于同一玻片以加快采集速度。采用VivaScope 2500M-G4?系统在数字染色模式下进行EVFCM成像。两名判读者（一名皮肤科医生兼主刀医生，一名病理科医生）均具有至少5年EVFCM图像判读经验，独立、盲法评估切缘状态。切缘被分类为无肿瘤、肿瘤浸润或不确定/不可评估。两名判读者一致判定为无肿瘤时方视为阴性；阳性、不一致或不确定结果均触发真实外切缘评估及序贯再切除。所有标本最终均行常规组织病理学检查（福尔马林固定、石蜡包埋、苏木精-伊红染色）作为金标准。采用Cohen’s κ统计量评估观察者间一致性及EVFCM与组织病理学的一致性，并计算敏感性、特异性、总体准确率及ROC曲线下面积（AUC）。
研究结果
人口学与病变特征：共纳入42个肿瘤（39例患者），患者平均年龄73.4±10.6岁（范围43-89岁），男性占79.9%。病灶主要位于头部美学敏感区域（鼻部26.2%、颧部21.4%、头皮-额部14.3%、眼周14.3%），躯干及上/下肢各占11.9%。组织病理学诊断包括：2例浅表BCC、18例结节性BCC、17例浸润性BCC、2例SCC原位/光化性角化病（actinic keratosis, AK）、2例浸润性SCC及1例神经鞘瘤。
切缘评估：共通过EVFCM评估223个手术切缘，其中外周切缘占79.8%（n=178），深部切缘占20.2%（n=45）。17%（n=38）的切缘初次分析为不确定或阳性，触发真实外切缘评估。切缘评估总数为261次。5.8%（n=13）的真实外切缘被判定为肿瘤浸润或不确定/不可评估，触发序贯切除，后续均一致判定为无肿瘤。皮肤科医生与病理科医生在切缘评估方面的观察者间一致性达到几乎完全一致（κ=0.863；SE 0.067；p<0.001；观察一致性98.6%）。与组织病理学金标准相比，EVFCM的敏感性为77.8%，特异性为97.2%，总体诊断准确率为96.4%，联合评估的AUC为0.875（SE 0.074；95% CI 0.730-1.000）。仅观察到两处EVFCM与组织病理学之间的不一致：第一处为外周切缘，组织病理学检测到浅表BCC条索而EVFCM未检出，构成假阴性评估；第二处涉及肿瘤床再切除后的深部切缘，不一致归因于两种技术间组织处理方式的差异。
组织学类型评估：EVFCM在组织学类型判定方面，皮肤科医生与病理科医生之间达到几乎完全一致（κ=0.882；SE 0.031；p<0.001；观察一致性97.6%）。BCC和SCC的肿瘤真皮聚集物在结节性和浸润性BCC及浸润性SCC中均得到一致诊断，仅1例BCC被错误识别为浅表型（组织学确认为浸润型）。判读者间最大分歧出现在BCC组织学亚型区分，尤其是结节性与浸润性BCC之间。研究人员认为，这一结节性BCC亚型的高估现象可能归因于研究设计的固有采样局限性——组织学类型判定仅基于单一中央切片，可能无法完整反映肿瘤的架构异质性。该发现与混合模式BCC的公认概念一致，即同一病灶内常并存多种组织病理学生长模式。
讨论与结论
本研究证实EVFCM是NMSC Mohs显微描记手术中术中切缘评估的可靠工具，其高诊断准确性与既往BCC相关研究报告的结果相当。皮肤科医生与病理科医生在切缘评估和组织学类型评估方面均表现出可比的诊断性能，支持经过充分培训的皮肤科医生可可靠执行EVFCM判读。研究中采用的外周切缘共同装片处理流程减少了样本操作次数（降低处理伪影风险），并有助于加快图像采集，同时未损害诊断准确性，在高通量Mohs单位中可能具有工作流程优势，但需以定量时间指标进行前瞻性验证。EVFCM的独特优势在于可对可疑区域进行图像堆栈采集，实时评估全层组织厚度，有助于在判定切缘阳性前进一步鉴别附件结构、皮脂腺小叶、炎性聚集物或处理伪影（如漂浮物）等可能的假阳性发现。研究局限性包括：样本量虽足以评估诊断性能但可能无法涵盖NMSC的全部组织病理学变异性；两名判读者均为经验丰富的EVFCM操作者，可能限制结果向经验不足者的推广；单中心标准化流程需多中心外部验证；AUC置信区间较宽反映阳性切缘事件数量有限。研究结论为：EVFCM支持作为NMSC Mohs手术中可靠的术中切缘评估工具，皮肤科医生与病理科医生可比的诊断性能支持其在专科手术环境中的潜在应用，前提是实施适当的培训；外周切缘共同装片处理流程在未损害诊断准确性的前提下有助于标本处理与图像采集，但相关工作流程优势仍属观察性发现，需以定量时间指标进行前瞻性验证。
