嘌呤可获得性决定复合物I缺陷成纤维细胞在依赖氧化磷酸化条件下的存活

《Mitochondrion》：Purine availability determines survival of complex I-deficient fibroblasts under OXPHOS-reliant condition

　　

•补充缺陷的复合体I亚基可改善依赖OXPHOS条件下复合体I缺陷成纤维细胞的活力
•嘌呤代谢功能障碍驱动依赖OXPHOS条件下复合体I缺陷成纤维细胞的死亡
•NAD+和AMP通过腺苷介导的IMP升高改善复合体I缺陷成纤维细胞的存活

1. 引言

原发性线粒体疾病（PMD）是一组由OXPHOS复合体亚基或其装配因子的致病性变异，或参与线粒体DNA复制、线粒体翻译或线粒体动力学（如融合和分裂）的蛋白质引起的遗传性代谢疾病，直接影响OXPHOS系统的功能（Chinnery, 2021）。PMD患者的治疗主要以支持性治疗为主，目前仅有少数亚型出现了获批的治疗方案，且只有小患者亚组受益（Leber遗传性视神经病变；Raxone（EPAR, 2015），Barth综合征；FORZINITY?（FDA, 2025），胸苷激酶2缺乏症；Kygevvi（EPAR, 2026））。缺乏线粒体功能障碍的获批药物部分原因在于患者临床表现异质性、诊断过程漫长以及缺乏可靠的治疗生物标志物（Zong等，2024）。尽管已知有超过300个基因以不同方式影响线粒体OXPHOS功能，但可能存在受影响的共同生化途径，需要对PMD的发病机制进行更多研究。

利用体外模型研究PMD具有挑战性，因为即使在有氧条件下，培养的人类皮肤成纤维细胞主要进行糖酵解，将丙酮酸还原为乳酸而不是将其氧化为乙酰辅酶A。这种现象在体外培养细胞中通常被称为Crabtree效应，类似于主要见于癌细胞的Warburg效应（de Kok, 2021）。尽管有不同类型的策略可诱导培养细胞依赖OXPHOS（de Kok, 2021），用其差向异构体半乳糖替代标准培养基中的葡萄糖仍然是一种快速且稳健的方法（Robinson等，1992）。半乳糖不是糖酵解的合适底物，因为它首先需要通过Leloir途径转化为葡萄糖，而该途径速率缓慢且消耗能量。在此条件下，具有不同OXPHOS缺陷的患者细胞无法存活（Robinson等，1992）。OXPHOS缺陷细胞与健康细胞之间的这种表型差异使得可以在该依赖OXPHOS的条件下测试可能改善OXPHOS缺陷细胞活力的潜在治疗药物。

鉴于PMD迫切需要广泛适用的治疗策略，支持核心线粒体代谢功能的分子，如NAD+，已成为特别有前景的药物候选物。NAD+是一种由含腺嘌呤和烟酰胺的核苷酸通过磷酸连接而成的不可或缺的辅酶（Nakamura等，2012）。已有研究表明，直接补充NAD+可升高细胞内NAD+水平，恢复氧化还原平衡，并改善依赖OXPHOS条件下复合体I缺陷患者成纤维细胞的活力（Iannetti等，2018）。然而，由于NAD+在血液循环中迅速降解，口服给药时生物利用度有限。因此，研究聚焦于NAD+前体物质，因为它们具有更高的生物利用度和稳定性，临床相关性更强（Jianying Zhang等，2025）。

NAD+由其前体物质（如色氨酸或烟酸）合成，但主要从NAM、NR或NMN循环再生（Imai, 2018）。TG是一种甲基化的NA衍生物，据推测可进入Preiss-Handler途径形成NAD+（Membrez等，2024）。NAD+作为NAD+/NADH和NAD(P)+/NADPH氧化还原偶联中的核心电子载体发挥作用。由于线粒体功能依赖于平衡的NAD(P)+/NAD(P)H池，NAD代谢物水平的任何改变都可能损害线粒体过程。在复合体I（NADH:泛醌氧化还原酶）缺陷时，NADH氧化为NAD+受阻，导致还原性应激（Xiao和Loscalzo, 2020），细胞可通过将丙酮酸转化为乳酸来再生NAD+从而部分代偿（Adant等，2022）。

在本研究中，使用NAD+前体物质处理复合体I缺陷患者成纤维细胞，以确定这些化合物是否能在依赖OXPHOS条件下重现NAD+的有益效果。此外，我们试图确定NAD+改善依赖OXPHOS条件下复合体I缺陷细胞活力的分子通路。

2. 材料与方法

2.1. 细胞系与细胞培养

本研究中所有来自患者前臂皮肤活检的主要人类成纤维细胞系（核编码复合体I亚基突变患者及健康对照）均由荷兰奈梅亨拉德布德大学医学中心（RadboudUMC）提供，并获得了捐赠者或患者家属的知情同意（相关信息列于补充表S1，包括Koopman等（2007）报道的复合体I活性）。细胞在含有10%（v/v）胎牛血清（FBS；#SV30160.03，Cytiva）和100 IU/mL青霉素/链霉素（P/S；#15140-122，Gibco）的含HEPES和L-谷氨酰胺的M199培养基（#22340-087，Thermo Fisher Scientific）（完全M199培养基）中培养，培养条件为37°C、5% CO2的湿化培养箱。细胞达到80%汇合度时进行传代，两次传代之间更换一次细胞培养液。

2.2. 化合物处理

化合物处理液配制于Dulbecco改良鹰 Eagles培养基（DMEM；#A1443001，Thermo Fisher Scientific）中，该培养基补充有2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMAX；#35050061，Thermo Fisher Scientific）、10%（v/v）透析FBS（#26400044，Thermo Fisher Scientific）、10 mM HEPES（#15630080，Thermo Fisher Scientific）、100 IU/mL P/S和0.02 mM酚红（#3532，Sigma-Aldrich），其中含5.5 mM葡萄糖（D(+)-葡萄糖；#1.08337.0250，Sigma-Aldrich）为对照条件，或含5.5 mM半乳糖（D(+)-半乳糖；#G5388，Sigma-Aldrich）。本文将其分别称为对照条件或依赖OXPHOS条件。本研究在葡萄糖和半乳糖培养基中均使用透析FBS，以降低正常FBS中的葡萄糖水平，该葡萄糖可能参与细胞代谢并干扰对照（葡萄糖培养基）与依赖OXPHOS（半乳糖培养基）条件比较的解读。

以下化合物直接溶解于对照或依赖OXPHOS条件培养基中至最终处理浓度：β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+；#HY-B0445，MedChemExpress）、烟酰胺（NAM；#N3376，Sigma-Aldrich）、β-烟酰胺单核苷酸（NMN；#HY-F0004，MedChemExpress）、烟酰胺核苷氯化物（NR；#HY-123033 A，MedChemExpress）、烟酸（Niacin；N4126，Sigma-Aldrich）、胡麻碱氯化物（#HY-N0415，MedChemExpress）、丙酮酸钠（#11360070，Gibco）、腺苷5'-单磷酸钠盐（AMP；#A1752，Sigma-Aldrich）、腺苷（#HY-B0228，MedChemExpress）、鸟苷（#HY-N0097，MedChemExpress）、胞苷（#HY-B0158，MedChemExpress）、尿苷（#HY-B1449，MedChemExpress）、腺嘌呤半硫酸盐（#HY-B0152B，MedChemExpress）、D-核糖（#HY-W018772，MedChemExpress）。每次实验前新鲜配制处理液。

2.3. 慢病毒互补

使用携带野生型NDUFS7亚基cDNA或GFP cDNA的构建体，通过慢病毒感染互补主要患者成纤维细胞PT3和PT4及对照成纤维细胞CT1，如Renkema等（2014）所述。

2.4. 活力测定

细胞经胰蛋白酶消化（胰蛋白酶-EDTA；#15400054，Gibco）后脱落，以每孔4500个细胞的密度接种于透明平底（#655180，Greiner Bio-One）或黑色微透明底（#655090，Greiner Bio-One）96孔板中，培养液为完全M199培养基。培养24小时后，去除培养基，用每孔200 μL基础培养基（含HEPES、GlutaMAX和P/S的无糖DMEM）洗涤4次。洗涤后，每孔加入150 μL处理培养基，培养72小时。培养结束后，用每孔100 μL不含酚红的M199（#11043023，Thermo Fisher Scientific）（洗涤液）洗涤细胞。然后加入50 μL含0.5 μM Calcein AM活力染料（#65-0853-39，Invitrogen）的洗涤液。在37°C、5% CO2湿化条件下孵育20分钟后，去除染色液，用每孔100 μL洗涤液洗涤两次。每孔加入100 μL洗涤液，使用BD Pathway 855高内容生物成像仪（Becton Dickinson）进行荧光显微镜成像。荧光显微镜图像数据按照Iannetti等（2016）的方法提取。活力量化为每孔中Calcein信号高于设定荧光强度阈值的像素总和。荧光显微镜图像的对比度提高了5-10%，仅用于可视化目的；数据分析基于原始'.tiff'文件独立进行，与信号强度无关。

2.5. 乳酸定量

使用改编自Schmiedeknecht等（2022）的酶循环方法，在处理72小时后的测定培养基中定量细胞外乳酸。简言之，L-乳酸脱氢酶（L-LDH；#10127230001，Roche）催化丙酮酸到乳酸的转化，与5-碘硝基四氮唑氯化物（INT；#HY-15920，MedChemExpress）到甲臜染料的转化通过1-甲氧基苯并噻嗪甲磺酸盐（m-PMS；#HY-D0937，MedChemExpress）耦联。测定缓冲液配制于含0.17 M Tris碱pH 8.2（#15504020，Invitrogen）、16.6 μM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、4.95 μM INT、34.7 pM L-LDH和67.5 pM m-PMS的缓冲液中。在对照条件培养基中配制0.75至12 mM的L-乳酸钠（#L7022，Sigma-Aldrich）标准品。50 μL样品/标准品与50 μL测定缓冲液在透明96孔测定板中混合。测定板在室温避光条件下孵育1小时。然后，每孔加入50 μL 1 M乙酸（#320099，Sigma-Aldrich）以终止反应。使用微孔板读数仪在490 nm和650 nm处测量吸光度。后者作为参考值从490 nm吸光度值中扣除。使用二阶多项式方程生成标准曲线。通过将样品的吸光度值对照标准曲线进行插值来确定样品中的L-乳酸浓度。仅在对照条件下报告乳酸，因为在依赖OXPHOS条件下乳酸无法检出。

2.6. 细胞内NAD+和ATP测定

为测定细胞内NAD+和ATP，细胞按上述方法进行铺板和处理。24小时后，用每孔200 μL基础培养基洗涤4次。

细胞内NAD+使用NAD/NADH-Glo测定试剂盒（#G9071，Promega）按照制造商方案定量。使用微孔板读数仪（FLUOstar Omega，BMG Labtech）记录发光信号（30个周期，1小时）。分析时，将发光动力学测量数据导入GraphPad Prism软件，计算NAD+标准品和实验样品的曲线下面积（AUC）。NADH浓度低于可靠检测范围，因此未报告。从50 μL的总裂解液体积中，取20 μL用于NAD+定量。

剩余的细胞裂解液（30 μL）用于定量细胞内ATP水平。为此，每孔加入30 μL含4 mM EDTA（#E4884，Sigma-Aldrich）和0.2%（v/v）Triton-X-100（#X100，Sigma-Aldrich）的ATP裂解缓冲液，以获得ATP/DNA稀释缓冲液中的样品。将10 μL样品和10 μL ATP标准品（#11140965001，Sigma-Aldrich，在ATP/DNA稀释缓冲液中的浓度为100-1000 nM）转移至白色平底96孔测定板。每孔加入90 μLATP测定缓冲液，该缓冲液含25 mM HEPES（#H3375，Sigma-Aldrich）pH 7.25、0.3 mM D-荧光素（#L2912，Thermo Fisher Scientific）、75 μM DTT（#43819，Sigma-Aldrich）、6.25 mM MgCl2（#76021126，Boom）、0.625 mM EDTA、1 mg/mL BSA（#A9647，Sigma-Aldrich）和0.5 μg/mL荧光素酶（#SRE0045，Sigma-Aldrich），用MilliQ水配制。将测定板在避光条件下冰上孵育10分钟，使用微孔板读数仪记录发光信号。使用ATP标准品插值样品浓度。

ATP测定中剩余的细胞裂解液（50 μL）用于Quant-iT PicoGreen dsDNA测定（#P-7589，Molecular Probes）进行DNA浓度定量。简言之，装有裂解液的测定板冻融3次。样品在ATP/DNA稀释缓冲液中稀释2.5倍。将50 μL稀释样品和dsDNA标准品（在ATP/DNA稀释缓冲液中的浓度为31.3-1000 ng/mL）转移至黑色V底96孔测定板（#651209，Greiner）。每孔加入50 μL TE缓冲液中稀释200倍的PicoGreen溶液。在暗处平板摇床上低速摇动孵育5分钟后，使用1000 ng/mL DNA标准品进行增益调整，测量荧光强度。使用DNA标准品插值样品浓度。

每个样品的NAD+和ATP值均按dsDNA浓度进行标准化。通过该方法，从相同的细胞裂解液中同时测量NAD+、ATP和dsDNA。

由于NAD+作为细胞处理化合物使用，评估了其可能对抗体测定的干扰。检测了细胞外NAD+的污染情况，确认用温热的基础培养基（DMEM）洗涤超过3次可消除3 mM NAD+。对于ATP测定，通过将ATP标准品加入400 nM NAD+来测试NAD+是否干扰测定，结论是该化合物无干扰。此外，通过测量一系列NAD+化合物浓度的ATP水平来测试NAD+处理是否可能在测定中增加ATP信号，结论是NAD+未引入假阳性信号。另外，通过向NAD+标准品中加入1 mM AMP、腺苷、鸟苷或尿苷来测试其他化合物对NAD+测定的干扰，未观察到交叉反应。

2.7. 代谢组学

细胞经胰蛋白酶消化后脱落，以14,000个细胞/cm2的密度接种于T25细胞培养瓶（#156367，Thermo Fisher Scientific）中。处理按上述方法进行。患者细胞用1 mM化合物处理，NAD+前体物质除外。由于NR和NMN升高细胞内NAD+水平的效果与1 mM NAD+处理相当，患者细胞分别用10 mM NR或3 mM NMN处理。由于NA和NAM未能升高NAD+水平，使用了本研究条件下最高无毒浓度（分别为10 mM和3 mM）。

治疗 24 小时后，通过胰蛋白酶消化收集细胞，随后在 4°C 下以 400g 离心 5 分钟。细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并将 100 μL (1:10) 细胞悬液分装到不同的管子中用于蛋白质含量测定。代谢组学和蛋白质测定样品在 4°C 下以 4200g 离心 3 分钟。去除上清液，细胞沉淀用 1 mL PBS 洗涤，随后在 4°C 下以 4200g 离心 3 分钟。尽可能去除上清液，样品液氮速冻并在 ?80°C 下储存直至测量。代谢组学分析采用液相色谱串联质谱 (LC-MS) 进行，如所述 (Schomakers et al., 2022)。代谢物的峰强度根据内标和蛋白质含量进行校正。使用所有化合物处理 (NAD+, 腺苷，AMP, NA, NAM, NR, NMN, 丙酮酸) 在患者细胞氧化磷酸化依赖条件下代谢物的倍数变化值进行相关分析。倍数变化通过比较有和无化合物的氧化磷酸化依赖条件计算得出。对于每种代谢物，倍数变化代表三个独立实验的平均值。当代谢物在氧化磷酸化依赖条件下未能一致检测到时将其排除 (即在至少一个重复中缺失) (72 种代谢物中有 4 种)。2.8. 数据分析
荧光显微镜图像使用 Image Pro Plus 软件 (Media Cybernetics) 进行分析。仅当患者细胞在治疗后 72 小时死亡时，氧化磷酸化活力实验才被纳入分析。相关和统计分析使用 GraphPad PRISM 软件进行。独立实验的总数标记为'N'，技术重复的总数标记为'n'。图中的数据表示为独立实验的平均值，箭头指示标准差。统计学显著性在每个实验的图例中标明。**** P < 0.0001, *** P < 0.001, ** P < 0.01, * P < 0.05。
3. 结果
3.1. 复合物 I 缺陷型患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下无法存活
由于复合物 I 缺陷型患者成纤维细胞在富含葡萄糖的培养基中生长相对良好，我们将其转移到含半乳糖的培养基中，以创建氧化磷酸化依赖条件 (OXPHOS-reliant condition) 进行分析。在该条件下，治疗 72 小时后分析细胞活力 (图 1a)。在对照条件下 (葡萄糖)，对照和患者成纤维细胞之间未观察到活力差异，而在氧化磷酸化依赖条件下，所有四种研究的患者成纤维细胞活力均显著降低，这与以前的报道一致 (Robinson et al., 1992; Iannetti et al., 2018) (图 1b,c)。
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图 1. 对照和复合物 I 缺陷型患者成纤维细胞在对照与氧化磷酸化依赖条件下的细胞活力 a) 实验工作流程图示。b) 代表性钙黄绿素荧光显微镜图像，展示在对照与氧化磷酸化依赖条件下治疗 72 小时后患者细胞和对照细胞的活力。c) 对照和患者成纤维细胞在对照和氧化磷酸化依赖条件下的细胞活力定量。(N = 2, 每条细胞系 n = 12)。数据使用双因素方差分析后进行 ?ídák's 多重比较检验进行分析。d) 细胞系在对照和氧化磷酸化依赖条件下的细胞活力定量，这些细胞系要么进行空载体互补 (+GFP)，要么用野生型 S7 亚基互补 (+S7)。(CT1 + S7 细胞系 N = 1 n = 2，其余细胞系 N = 3 n ≥ 9)。数据使用双因素方差分析后进行 ?ídák's 多重比较检验进行分析。
为了确认复合物 I 活性缺乏是患者细胞在氧化磷酸化依赖条件下无法存活的原因，我们将从两条患者来源的成纤维细胞系 (PT3 和 PT4)，其复合物 I 核编码 NDUFS7 亚基存在突变，以及一条对照细胞系 CT1，转导了野生型 NDUFS7 亚基的 cDNA。与空载体转导 (PT3 + GFP 和 PT4 + GFP) 相比，转导野生型 NDUFS7 的患者成纤维细胞的复合物 I 活性 (PT3 + S7 和 PT4 + S7) 增加，确认了如 (Pecheritsyna et al., 2026) 所报道的，通过 NDUFS7 亚基互补恢复了复合物 I 活性。如预期那样，所有成纤维细胞系在对照条件下具有相当的活力。然而，在氧化磷酸化依赖条件下，PT1 和空载体转导的患者成纤维细胞活力显著降低。用野生型 S7 亚基 cDNA 纠正的患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下的活力得到了挽救 (图 1d)。这些结果表明，复合物 I 缺陷是导致患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下细胞活力降低的根本原因。
3.2. NAD+ 前体并不能改善患者细胞活力或降低乳酸水平
先前研究表明，在氧化磷酸化依赖条件下，直接补充 NAD+ 可恢复复合物 I 缺陷型原代成纤维细胞的活力至对照水平 (Iannetti et al., 2018)。这一发现促使我们测试生物利用度在体外和体内更好的 NAD+ 前体，如 NAM、NMN、NR、NA 和 TG，是否能提供类似益处。为这些实验选定的细胞具有故意设计为非常不同的残余复合物 I 活性 (PT1 和 PT2 分别为 68% 和 18%)。
在对照条件下，患者细胞和对照细胞对高达 3 mM 的 NAD+ 前体耐受性良好，仅在 NAM、NMN 和 NAD+ 高达 10 mM 的非生理浓度下观察到毒性 (图 S2a-f)。在氧化磷酸化依赖条件下，患者成纤维细胞的细胞活力仅在 NAD+ 处理下得到改善 (图 2)。此外，10 mM NA 处理显著改善了 PT2 细胞在氧化磷酸化依赖条件下的活力，PT1 细胞活力改善呈趋势，但仅在 10 mM 时，这是一个超生理浓度 (图 2b)。由于乳酸产生增加被认为是原发性线粒体疾病 (PMD) 的标志，因此在对照条件下用 NAD+ 和 NAD+ 前体处理 72 小时后，定量分析了培养基中的乳酸水平 (图 S2g-l)。NAD+ 处理显著降低了患者和对照细胞系两者的细胞外乳酸水平 (图 S2l)。与对活力无影响类似，NAD+ 前体对细胞外乳酸水平没有显著影响。我们得出结论，与 NAD+ 相反，NAD+ 前体在该模型系统中未能有效挽救复合物 I 缺陷型成纤维细胞。
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图 2. 在氧化磷酸化依赖条件下用 NAD+ 和 NAD+ 前体处理的细胞活力。在氧化磷酸化依赖条件下，用剂量范围 a) TG、b) NA、c) NAM、d) NR、e) NMN 和 f) NAD+ 处理对照和患者成纤维细胞的细胞活力定量。(N ≥ 3, 每个剂量每条细胞系 n ≥ 6)。数据使用双因素方差分析后进行 Dunnett's 多重比较检验进行分析。
3.3. NAD+ 及其结构组分均改善患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下的活力
由于 NAD+ 本身无法直接完整进入细胞 (Billington et al., 2008; Jie Zhang et al., 2018)，我们研究了其降解产物如 AMP 和腺苷是否解释了观察到的活力增加。在氧化磷酸化依赖条件下，用 AMP 和腺苷处理对照和患者成纤维细胞，并使用丙酮酸和 NAD+ 作为阳性对照。在氧化磷酸化依赖条件下，用 1 mM 丙酮酸、NAD+、AMP 或腺苷处理后，患者成纤维细胞的活力恢复至对照水平 (图 3a)。在氧化磷酸化依赖条件下，用剂量范围的 NAD+、AMP 和腺苷处理患者成纤维细胞，所有这些化合物产生了可比较的 EC50 值 (约为 50–80 μM) (图 3b, c, d, e)。这种相似性表明这些化合物可能通过相似机制改善患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下的活力。
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图 3. 在氧化磷酸化依赖条件下用 NAD+ 及其结构组分处理改善患者成纤维细胞活力 a) 在氧化磷酸化依赖条件下 (载体) 或补充 1 mM 丙酮酸、NAD+、AMP 或腺苷后，对照和患者成纤维细胞的细胞活力定量。患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下 (?) 用剂量范围的 NAD+、AMP 或腺苷处理的细胞活力定量 b) PT1, c) PT2, d) PT3, e) PT4。(N ≥ 3, n ≥ 6)。数据使用双因素方差分析后进行 Dunnett's 多重比较检验进行分析。
3.4. 嘌呤核苷促进患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下的存活
已知线粒体功能障碍会破坏核苷酸代谢 (如 (MacVicar, 2025) 所述)。由于腺苷改善了患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下的细胞活力，我们进一步检查了其他嘌呤和嘧啶核苷是否产生类似效果。在氧化磷酸化依赖条件下，用不同浓度的鸟苷、胞苷和尿苷处理对照和患者成纤维细胞。与腺苷类似 (图 3a, b)，鸟苷显著改善了患者成纤维细胞活力 (图 4a)。胞苷处理没有效果 (图 4b)，而尿苷仅显示 PT1 细胞活力有轻微 (10%) 改善 (图 4c)。因此，我们得出结论，嘌呤而非嘧啶核苷在氧化磷酸化依赖条件下给患者细胞提供最稳健的细胞活力益处。糖酵解活性降低可能会限制核糖的可用性。为了测试嘌呤核苷改善活力是否通过核糖回收介导 (图 4d)，在氧化磷酸化依赖条件下用腺嘌呤、核糖或腺苷处理患者细胞 (图 4e)。腺嘌呤碱基或核糖处理均未改善患者细胞活力。结果表明，在氧化磷酸化依赖条件下改善患者细胞活力需要嘌呤核苷代谢，无法通过单独补充核糖或嘌呤碱基来重现。
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图 4. 嘌呤核苷处理改善患者成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下的活力。在氧化磷酸化依赖条件下 (x = 0)，对照和患者成纤维细胞的细胞活力定量，以及 a) 0.3–3 mM 鸟苷，b) 0.3–3 mM 尿苷，或 c) 0.3–3 mM 胞苷补充在氧化磷酸化依赖条件下。d) 腺嘌呤、核糖和腺苷的化学结构。由 MolView.org 创建 e) 在氧化磷酸化依赖条件下或补充 1 mM 腺嘌呤、核糖或腺苷后，患者成纤维细胞细胞活力定量。(N = 3, n ≥ 6)。数据使用双因素方差分析后进行 Dunnett's 多重比较检验进行分析。
3.5. 在氧化磷酸化依赖条件下 NAD+ 或 ATP 补充与改善细胞活力之间无相关性
先前研究表明，在氧化磷酸化依赖条件下 NAD+ 和 ATP 水平均可能降低 (Iannetti et al., 2018; Orlicka-P?ocka et al., 2020; Dott et al., 2014)。因此，我们定量分析了该条件下细胞内的 NAD+ 或 ATP 水平。从对照切换到氧化磷酸化依赖条件后，经过 24 小时处理，PT1 细胞内的 NAD+ 或 ATP 水平未改变 (对照条件的 102%)，但 PT2 成纤维细胞 (具有较低的残余复合物 I 活性) 中这两种代谢物均显著下降 (对照条件的 62%) (图 5a, b, S1)。NAD+、NMN 和 NR 处理显著增加了两条细胞系的细胞内 NAD+ 水平，而 TG、NA 和 NAM 没有效果 (图 5a)。AMP 和腺苷降低了 PT1 细胞系的 NAD+ 水平，但未影响 PT2 细胞系。在所有化合物中，只有 NAD+ 处理增加了两条患者成纤维细胞系的 ATP 水平 (图 5b)。总之，细胞内 NAD+ 或 ATP 水平的变化与在氧化磷酸化依赖条件下观察到的活力挽救并不相关。
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图 5. 化合物处理后细胞内 NAD+ 和 ATP 测量 PT1 和 PT2 成纤维细胞在氧化磷酸化依赖条件下 (标记为 OXPHOS) 处理 24 小时，处理条件为：在氧化磷酸化依赖条件下加入 1 mM NAD+、丙酮酸、TG、NA、NAM、NR、NMN、AMP、腺苷 (A)、鸟苷 (G) 或尿苷 (U)。A) 细胞内 NAD+ 水平 b) 细胞内 ATP。(N ≥ 3, 每条细胞系 n ≥ 9)。数据使用双因素方差分析后进行 Dunnett's 多重比较检验进行分析。时间过程实验，c) 细胞内 NAD+ 和 d) PT1 和 PT2 成纤维细胞在对照条件、氧化磷酸化依赖条件下或补充 3 mM NMN、10 mM NR 或 1 mM NAD+ 在氧化磷酸化依赖条件下的 ATP 测量 (N = 2, 每条细胞系 n = 4)。显著性计算基于每个时间点与氧化磷酸化依赖条件值的比较，使用双因素方差分析后进行 Dunnett's 多重比较检验。
为了评估 ATP 和 NAD+ 水平随时间的反应，进行了时间过程分析，随后用 NAD+ 和选定的前体 (NR 和 NMN，两者均在治疗 24 小时后增加 NAD+ 水平) 进行处理 (图 5c)。在氧化磷酸化依赖条件下，1 mM 剂量的 NAD+ 处理后 8 小时细胞内 NAD+ 水平略有增加，24 小时后增加更为明显 (图 5c)。相反，该处理在 2 小时内迅速使细胞内 ATP 水平提高了 1.9 倍 (图 5d)。另一方面，NMN 和 NR 处理对 NAD+ 产生了更快的效果：这两种前体均在 2 小时内使细胞内 NAD+ 水平提高了 1.7 倍 (图 5c)。NMN 还诱导了细胞内 ATP 的短暂增加，但在 8 小时时间点恢复至对照水平 (图 5d)。

综上所述，这些结果表明，在这些条件下，NMN和NR能够快速发挥作用并有效提升细胞内NAD?水平，而直接补充NAD?则更迅速地增加ATP水平。这些不同的响应证实，NAD?处理改善患者细胞活力的作用并不依赖于提高细胞内NAD?水平。

3.6 复合体I活性丧失损害依赖OXPHOS的嘌呤生物合成，代谢组学分析揭示这一现象

为了更深入地了解依赖OXPHOS条件对细胞代谢的影响，并鉴定促进患者细胞存活的候选代谢物，我们对处理24小时后收集的细胞提取物进行了代谢组学分析。利用液相色谱-质谱（LC-MS）共检测到72种代谢物。在对照条件下，对照成纤维细胞与患者成纤维细胞之间无显著差异的代谢物，表明当培养条件中存在葡萄糖时，两者的代谢组谱相似（图S3a）。相比之下，从对照条件切换至依赖OXPHOS条件时，对照和患者成纤维细胞均出现显著的代谢变化。在对照细胞中，这种切换产生了预期的与OXPHOS相关的响应：苹果酸和柠檬酸水平升高，NADH水平降低（Liu et al., 2018; Singh et al., 2024）（图6a）。然而在患者成纤维细胞中未观察到这一现象，相反，一磷酸核苷AMP和CMP的水平略有升高（图6a）。在患者和对照成纤维细胞中，依赖OXPHOS条件均引起天冬氨酸水平的可比性升高和谷氨酰胺水平的降低，这一模式与增强的谷氨酸依赖性转氨基作用一致，该途径已知可支持增殖细胞（Alkan et al., 2018）。在患者细胞中，尿苷水平在依赖OXPHOS条件下降低，而UDP-己糖水平无显著变化；而在对照细胞中，尿苷二磷酸（UDP）-己糖水平降低。因此，这些发现表明，对照成纤维细胞表现出典型的OXPHOS驱动的代谢转变，而复合体I缺陷的患者细胞则启动不同的代偿途径，特别是在线粒体应激下的核苷酸代谢中。

图6. 对照（CT1和CT2）和患者（PT1和PT2）成纤维细胞在不同条件下处理24小时后的代谢组学LC-MS分析。a) 从对照条件切换至依赖OXPHOS条件时，对照和患者成纤维细胞中显著变化（配对t检验分析，P < 0.05）的代谢物的倍数变化。b) 使用患者成纤维细胞中经1 mM NAD?、1 mM AMP、1 mM腺苷（ADE）、10 mM NR、10 mM NA、3 mM NAM、3 mM NMN或1 mM丙酮酸处理相对于依赖OXPHOS条件的代谢物倍数变化计算的Pearson相关性矩阵热图。c) 患者成纤维细胞在依赖OXPHOS条件下经1 mM NAD?、ADE或AMP处理后显著变化代谢物（配对t检验分析，P < 0.05）的文氏图。↑表示代谢物水平升高；↓表示代谢物水平降低。代谢分析在3个生物学重复中进行，每个细胞系每条件1个样本。*表示腺苷处理后IMP的倍数变化（4.2倍）、AMP处理后（5.8倍）或NAD?处理后（18倍）。d) 对照条件和依赖OXPHOS条件下患者和对照成纤维细胞中IMP水平的柱状图，以各细胞对照条件的平均值进行标准化（N ≥ 2，每个细胞系）。

随后，我们检查了患者在依赖OXPHOS条件下对各处理剂的代谢响应。对检测到的代谢物在所有化合物处理下相对于依赖OXPHOS条件的平均倍数变化进行相关性分析，揭示了若干强配对关系（图6b）。在改善患者细胞活力的处理中，AMP和腺苷处理与NAD?表现出高度相关性（r > 0.5），这与它们与NAD?的结构关联一致。

为鉴定驱动治疗剂增强活力效应的具体代谢物，我们进一步检查了NAD?、AMP和腺苷在依赖OXPHOS条件下诱导的特异性代谢物变化。AMP和腺苷处理均中度升高了支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）以及与一碳代谢相关的代谢物，如丝氨酸、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）。在NAD?、AMP和腺苷处理细胞的代谢谱中，大多数显著改变的代谢物变化倍数均小于2倍（图6c）。相比之下，次黄嘌呤核苷酸（IMP）——嘌呤生物合成中的关键中间体——显示出明显更大的增幅，经腺苷、AMP或NAD?处理后分别升高4.2倍、5.8倍和18倍。IMP的这种显著升高表明，嘌呤生物合成是这些在依赖OXPHOS条件下增强活力的处理剂激活的主要代谢途径。

我们接下来检查了在OXPHOS应激下的基础IMP水平是否有助于解释患者细胞与对照细胞之间观察到的活力差异。在对照条件下，IMP水平变异较大，患者细胞的平均值高于对照细胞，但该差异不具有统计学意义（图6d）。然而在依赖OXPHOS条件下，IMP在两组中表现截然不同。在对照细胞中，IMP水平相对于对照条件升高（图6e），而在患者细胞中，PT1和PT2的IMP水平分别降低了50%和75%（图6e），表明在线粒体应激期间维持嘌呤核苷酸池的能力受损。

为确定非嘌呤类增强活力的处理剂是否通过IMP依赖或非依赖途径发挥作用，我们接下来检查了NA和丙酮酸。NA部分改善了PT2的活力，显示图S3b中八种代谢物有轻微（倍数变化 < 1.5）但显著（P < 0.05）的变化。丙酮酸改善了两种患者细胞的活力，使细胞内乳酸水平升高1.53倍，可能通过NADH循环促进NAD?再生（图S3c）。这些响应在IMP无明显变化的情况下发生，表明丙酮酸和NA通过IMP非依赖机制支持患者成纤维细胞的存活。

有趣的是，代谢物变化中整体相关性最强的是AMP与NR处理之间；然而，只有SAH被AMP和NR同时显著升高（图6b-c，S3d）。NMN和NR处理将IMP水平升高3.4倍或更低（图S3e）；然而这些处理均未改善患者在依赖OXPHOS条件下的细胞活力。这可能表明IMP升高存在一定阈值才能达到可检测的活力改善效果，但仅IMP升高尚不充分。

综合来看，这些结果表明，依赖OXPHOS条件与复合体I缺陷患者细胞中IMP水平降低相关，而挽救活力的处理剂（NAD?、AMP或腺苷）可恢复IMP水平。因此，这些发现支持这样一个模型：在依赖OXPHOS条件下，NAD?、AMP和腺苷的增强活力效应可能通过补充IMP水平和激活嘌呤生物合成来介导。

4. 讨论

先前的研究表明，在依赖OXPHOS条件下直接补充NAD?可改善复合体I缺陷细胞的活力（Iannetti et al., 2018）。通过补充NAD?前体间接升高细胞内NAD?浓度是否具有与NAD?相同的效果此前尚未进行测试，而NAD?前体因其更好的吸收性和稳定性，在治疗潜力上优于NAD?（Yusri et al., 2025）。

NAD?前体已在一些线粒体原发性疾病（PMD）的体外模型中显示出代谢益处，例如NR通过升高NAD?水平和激活Sirtuin依赖性途径主要在NDUFS4缺陷的iPSC来源神经元中发挥挽救作用（Yoon et al., 2022），以及在线粒体DNA突变（m.3243 A > G）成纤维细胞中降低NADH水平（Liufu et al., 2023）。然而，这些效应是在标准富葡萄糖条件下证实的。在我们的依赖OXPHOS设置中，NAD?前体如NR和NMN升高了NAD?水平，但未改善依赖OXPHOS条件下的ATP水平或复合体I缺陷患者细胞活力，也未改善乳酸积累。仅在PT2细胞系中以非生理性浓度10 mM观察到NA对患者细胞活力的轻微改善。值得注意的是，在依赖OXPHOS条件下，我们的成纤维细胞模型中未观察到NA处理后稳态NAD?或ATP水平升高。由于直接NAD?处理能迅速升高细胞内ATP水平，仅在较晚时间点升高NAD?水平并改善活力，这些结果支持这样一个模型：NAD?早期降解为AMP和腺苷可能首先补充腺苷酸分子池，而NAD?升高则发生在较晚阶段。NR、NMN和NA缺乏此效应，这可能部分解释了它们在生理浓度下无法挽救活力的原因。因此，细胞活力的改善与化合物调节细胞内NAD?和/或ATP水平的能力之间无直接相关性。

线粒体功能障碍通过耗竭呼吸依赖性前体如天冬氨酸而扰乱嘌呤代谢，通过抑制性中间产物如延胡索酸的积累抑制从头合成，并破坏维持线粒体和核基因组稳定性所需核苷酸池平衡的特化转运体和补救酶（MacVicar, 2025）。化合物处理对代谢物最显著的影响是NAD?、AMP和腺苷升高IMP水平，提示嘌呤核苷酸代谢是依赖OXPHOS条件下的靶标途径。NR和NMN仅轻度升高IMP，而NA对IMP水平无影响，这与其对患者细胞活力影响有限或无影响相一致。这可能表明在依赖OXPHOS条件下，IMP水平需达到一定阈值才能显示活力改善效果。NAD?、AMP和腺苷产生的代谢特征高度相似，表明这些化合物的作用模式相似，涉及嘌呤补充；而NAD?前体主要提升NAD?本身，未能有效支持嘌呤池。我们的发现与一项研究报告一致，该报告显示肌苷（IMP的核苷部分）补充可恢复半乳糖血症患者细胞的活力，这些细胞因缺乏代谢半乳糖的Leloir途径中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶而无法在含半乳糖培养基中生长（Pourci et al., 1990）。综合这些观察，支持这样一个模型：依赖OXPHOS条件下的活力挽救需要恢复嘌呤中间体，尤其是IMP。单独使用核糖或腺嘌呤嘌呤碱基未能改善患者细胞活力的事实表明，细胞能量状态不足以在依赖OXPHOS条件下满足从头嘌呤生物合成途径恢复IMP水平的能量需求，使细胞完全依赖于更快速且能量效率更高的补救途径。

如图7所述，我们提出：在正常条件下，复合体I缺陷皮肤成纤维细胞依赖嘌呤补救途径生成IMP，并受益于通过糖酵解快速合成ATP。依赖OXPHOS条件使从头合成和补救途径都难以维持。NAD?、AMP和腺苷的处理可能绕过这些合成步骤，降低对循环（如三磷酸分子ATP）的依赖，帮助细胞稳定IMP水平，如本文所示，这些水平在患者细胞中因依赖OXPHOS条件而降低。外源性NAD?、AMP和腺苷是否在细胞内直接转化为IMP（通过腺苷向肌苷的转化），本研究未解答此问题，将作进一步探索。尽管我们的研究确定了依赖OXPHOS条件下嘌呤代谢的显著改变，但使用同位素示踪直接评估代谢通量将进一步完善对嘌呤代谢的理解。

图7. NAD?介导改善复合体I缺陷患者细胞活力的拟议机制示意图。OXPHOS受损使细胞依赖嘌呤补救途径。快速ATP合成和通过糖酵解的NADH循环在对照条件下补偿嘌呤补救。依赖OXPHOS条件限制了这种快速ATP周转并改变氧化还原状态，最终导致嘌呤前体IMP水平降低。在依赖OXPHOS条件下补充NAD?时，NAD?降解为AMP可升高细胞内IMP水平，同时恢复ATP水平。NMN部分负责随后NAD?水平的升高。使用BioRender.com制作。

本研究的一个重要局限性在于，研究结果是在依赖OXPHOS条件下培养的患者来源成纤维细胞中获得的。尽管这是一种公认的揭示细胞脆弱性的体外策略，但它无法提供关于体内系统性嘌呤代谢的信息。因此，嘌呤代谢目前应被视为候选代谢脆弱性而非已验证的治疗靶标。未来研究应首先确定本研究中发现的嘌呤改变是否在相关的体内复合体I缺陷模型（如Ndufs4缺陷小鼠）中得到重现，然后再评估药物干预的效果。

5. 结论

本研究强调了嘌呤代谢是依赖OXPHOS条件下复合体I缺陷成纤维细胞生存的瓶颈。NAD?和AMP通过腺苷提高IMP水平从而改善患者细胞存活，进而可平衡AMP和ATP周转。此外，本研究提供了关于"半乳糖试验"的新机制见解，确立了嘌呤代谢功能障碍为患者细胞死亡的致病途径。

我们的研究结果突出了嘌呤代谢的双重意义：它既是值得进一步体内实验验证的候选治疗靶点，也是改进以半乳糖检测为驱动的药品发现策略的基础。

**CRediT作者贡献声明**

Melisa Emel Ermert：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，可视化，方法论，调查研究，构思。
Bas Pennings：方法论，调查研究。
Anja Perkovic：调查研究。
Svetlana Pecheritsyna：撰写–审阅与编辑，指导，方法论，构思。
Bauke Schomakers：撰写–审阅与编辑，调查研究。
Michel van Weeghel：撰写–审阅与编辑，调查研究。
Jan Smeitink：撰写–审阅与编辑，指导，获取资金。
Riekelt Houtkooper：撰写–审阅与编辑，指导，获取资金，构思。
Eija Pirinen：撰写–审阅与编辑，指导。
Herma Renkema：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，验证，指导，方法论，构思。

**资金支持**

本项目获得了欧洲联盟地平线欧洲研究与创新计划通过NADIS项目（编号：101073251；www.nadis.eu）提供的资金支持。E.P.获得了芬兰研究理事会Profi6资助（拨款编号：336449），资助对象为奥卢大学。

Melisa Emel Ermert | Bas Pennings | Anja Perkovic | Svetlana Pecheritsyna | Bauke Schomakers | Michel van Weeghel | Jan Smeitink | Riekelt Houtkooper | Eija Pirinen | Herma Renkema