《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Physiological diversity and adaptation of Rhizaria revealed by phylogenomics and comparative transcriptomics
编辑推荐：
根足虫类（Rhizaria）是了解最有限但最多样化的微生物真核生物支系之一。本研究通过系统基因组学解析了丝足虫纲（Thecofilosea）的深层进化关系，发现正源基因群（orthogroups）组成与表达模式反映了系统发育距离，群体水平转录组揭示了谱系相关的
根足虫类（Rhizaria）是了解最有限但最多样化的微生物真核生物支系之一。本研究通过系统基因组学解析了丝足虫纲（Thecofilosea）的深层进化关系，发现正源基因群（orthogroups）组成与表达模式反映了系统发育距离，群体水平转录组揭示了谱系相关的功能模式，即使在形态保守的分类单元中代谢也存在差异，而生理分化表明基因丢失与获得驱动的生态灵活性。研究人员对12株Rhogostoma及其他丝足虫纲代表进行了深度测序的群体水平转录组分析，建立了多基因系统基因组框架以解析这一特征不明的支系内部关系。研究发现，共享正源基因群数量与系统发育距离呈负相关，两个Rhogostoma簇在正源基因组成和表达模式上显著分离，主成分分析解释了82%的总变异。代谢通路重建显示，中心碳代谢和核苷酸代谢高度保守，而氨基酸和脂质代谢呈现较大变异性——例如精氨酸、色氨酸、组氨酸和赖氨酸的生物合成基因仅在Fisculla terrestris和Katarium polorum中被检测到。此外，Rhogostoma簇1在信号转导、感觉系统和环境适应方面富集了更多正源基因，包括cGMP依赖性蛋白激酶（PRKG1/2）、丝裂原活化蛋白激酶（MAP3K7, MAP3K9, MAP3K12, MAP3K13）以及瞬时受体电位阳离子通道A亚家族成员1（TRPA1/ANKTM1）。这些结果表明，即使是形态高度相似的近缘物种，其生理潜能也存在显著差异，暗示丝足虫纲可能经历了从寄生向自由生活方式的二次转变，并通过基因丢失与获得驱动了生态可塑性和物种多样化。
研究背景与科学问题
根足虫类（Rhizaria）是微生物真核生物中了解最少但多样性极高的支系之一，涵盖重要的海洋捕食者（如有孔虫Foraminifera、放射虫Radiolaria、暗囊虫Phaeodaria）、光合自养类群（如Paulinella chromatophora和绿蛛网藻chlorarachniophytes）以及多种寄生性物种（如引起十字花科作物减产高达15%的Plasmodiophora brassicae）。其中，丝足虫纲（Thecofilosea）是根足虫中在土壤和极地海洋等生态系统中最丰富的类群之一，包含噬菌者、噬真核生物者以及专性藻类拟寄生物等多种营养策略。然而，尽管丝足虫纲分布广泛且多样性高，许多异养支系的系统发育关系和功能分化仍不清晰，尤其是在丝足虫纲内部，单基因或少基因系统树对Rhogostoma科内关系的解析能力有限，基因组和转录组资源也极为匮乏。这限制了研究人员判断形态高度保守的Rhogostoma属内部巨大的遗传多样性是否伴随相应的功能和代谢差异。为此，研究人员开展了本项研究，旨在通过系统基因组学和比较转录组学揭示丝足虫纲的生理多样性与适应性机制。
研究设计与主要结论
研究人员对12株Rhogostoma菌株（来自德国莱比锡洪泛区森林等地）以及其他丝足虫纲代表（包括Katarium polorum、Fisculla terrestris、两种Protaspidae sp.以及Ebriida sp.）进行了深度测序的群体水平转录组分析。所有Rhogostoma菌株在相同条件下（小麦草培养基，约4°C）培养，RNA提取时细胞处于所有生命阶段混合状态。通过与已发表的28个根足虫转录组/基因组数据整合，研究人员建立了包含222个串联基因（71479个氨基酸位点）的多基因系统基因组框架。结果表明，丝足虫纲内部关系得到高度支持：Tectofilosida（包含Fisculla terrestris和Katarium polorum）形成完全支持的单系群；Ebriida、Matazida和Cryomonadida形成高度支持的分支；Cryomonadida内部分为两个完全支持的单系亚支——Protaspidae和Rhogostoma，后者进一步分为两个各有6株菌的簇（簇1短分支，簇2长分支）。
主要关键技术方法
- 1.
系统基因组学分析：采用PhyloFisher v.1.2.13鉴定240个直系同源基因，经筛选后构建222基因串联比对矩阵（覆盖40个根足虫类群），使用IQ-Tree v.2.1.2以LG+C60+F+Γ位点异质性混合物模型构建最大似然树，并以1000次超快自举（UFB）和SH近似似然比检验评估支持度。
- 2.
转录组组装与功能注释：使用Trinity v.2.14.0组装mRNA序列，TransDecoder v.5.5.0预测编码区，BUSCO v.5.2.2评估完整性（平均86%）。通过eggNOG-mapper v.2.1.9基于KEGG数据库进行功能注释。
- 3.
正源基因群与差异表达分析：使用OrthoFinder v.2.5.2鉴定系统发育层次正源基因群，Salmon v.1.9.0定量基因表达，DESeq2 v.1.44.0进行差异表达分析（|log2倍变化|≥1，校正p值<0.001），GOseq v.1.56.0进行KEGG功能富集分析。
- 4.
代谢通路重建：基于KEGG模块逐步骤评估氨基酸、核苷酸、碳水化合物和脂质代谢通路的完整度，利用Cytoscape v.3.9.0可视化中心碳和氨基酸代谢网络。
研究结果
3.1 系统基因组学分析：通过222个串联基因（71479个氨基酸）的系统发育分析，研究人员获得了丝足虫纲内部高度支持的骨架关系。Tectofilosida（Fisculla terrestris和Katarium polorum）形成完全支持的单系群；Ebriida、Matazida和Cryomonadida构成高度支持的分支；Cryomonadida内部分为Protaspidae和Rhogostoma两个完全支持的单系亚支，后者进一步分为两个各有6株菌的簇（簇1短分支，簇2长分支）。
3.2 转录组与正源基因群分析：14个转录组共93%的预测开放阅读框被分配到58676个正源基因群，核心正源基因群（所有菌株共有）为4178个，富含遗传信息处理相关功能（复制修复、转录、翻译）。正源基因群重叠程度反映系统发育关系——亲缘关系越近共享越多。Rhogostoma簇1共享4612个独特正源基因群，显著高于簇2的704个。簇1在信号转导、感觉系统和环境适应方面比例更高，主导KO术语包括cGMP依赖性蛋白激酶（PRKG1/2）、丝裂原活化蛋白激酶（MAP3K7, MAP3K9, MAP3K12, MAP3K13）和感觉离子通道TRPA1/ANKTM1；簇2则在运输和分解代谢方面比例更高。Tectofilosida两个物种均表现出大量独特正源基因群（Fisculla 5134个，Katarium 3417个），且在细胞运动方面比例更高。
3.3 代谢通路探索：中心碳代谢和核苷酸代谢基因整体完整，但丙酮酸氧化途径仅在14株中的6株可完整重建，Rhogostoma簇2的非氧化磷酸戊糖途径基因平均少于其他菌株。核苷酸生物合成基因普遍存在，但de novo嘌呤生物合成基因仅在Katarium polorum中发现。氨基酸和脂质代谢变异性更大：精氨酸、色氨酸、组氨酸和赖氨酸生物合成基因主要在Fisculla terrestris和Katarium polorum中检出；Fisculla terrestris还具备亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸生物合成基因。脂质代谢中，Rhogostoma簇2菌株在C18/19/21-甾体生物合成方面拥有更多酶类。
3.4 富集分析：基于20000个正源基因群的PCA显示，Rhogostoma簇1和簇2沿第一轴明显分离（解释82%总变异），簇2内部变异占5%，同种菌株聚集在一起。差异表达分析鉴定出7502个差异表达正源基因群，后续富集分析在Rhogostoma簇1的所有6株菌中一致富集了15个KO术语，包括锚蛋白重复结构域28/44（ANKRD28/ANKRD44）、三聚体自转运粘附素（ata/sadA/emaA）、凝集素样蛋白（ALS）、粘蛋白13（MUC13）和TRPA1/ANKTM1。Rhogostoma簇2中未发现跨所有菌株一致富集的KO术语。
讨论与结论
研究人员发现丝足虫纲共享一套保守的核心正源基因群和通路，包括遗传信息处理和中心碳/核苷酸代谢，但氨基酸和脂质代谢在不同菌株间呈现显著变异。特别是，Rhogostoma属（形态高度相似）表现出高生理可变性——簇1在信号感知和环境响应方面富集，簇2则在物质运输和分解代谢方面优势。结合系统发育分析（Cryomonadida与高度特化的藻类拟寄生类群Protaspidae为姐妹群），研究人员提出假说：Cryomonadida的祖先可能经历了向寄生特化过程中的功能与基因组多样性丢失，随后Rhogostoma的祖先拓宽了狭窄的猎物范围，转向以细菌为主要食物来源的自由生活方式。这种从寄生向自由生活的二次转变可能通过水平基因转移（HGT）获得新功能，从而驱动了现今Rhogostoma显著的物种多样性。
结论：高质量的转录组覆盖率和丝足虫纲自由异养类的深度采样系统发育树，为研究人员理解其功能和代谢潜力提供了新的进化视角。丝足虫纲共享保守的核心正源基因群（涉及遗传信息处理、核苷酸代谢和中心碳代谢），而氨基酸和脂质代谢则表现出更大的菌株间变异性。功能正源基因群组成和表达模式揭示了广泛的谱系相关功能性状差异，表明即使是亲缘关系密切、形态高度相似的分类单元也具有显著的生理多样性。鉴于丝足虫纲仅代表巨大原生生物多样性的极小部分，本研究结果进一步强调了开展更多异养原生生物比较研究的必要性。更广泛而言，本研究展示了将系统基因组学与比较转录组学相结合，为研究不足的微真核生物支系构建进化和功能假说的潜力。
