《Molecules and Cells》：Divergent proteomic landscapes and functional requirements for telomere maintenance in type I and type II ALT mESCs
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端粒替代延长（ALT）是一种不依赖端粒酶、基于重组的途径，部分癌症采用该途径。研究人员先前建立了源自小鼠胚胎干细胞（mESCs）的两种不同类型ALT存活细胞，其特征分别为独特的非端粒插入序列（I型）或典型端粒重复序列（II型）。本研究采用端粒特异性蛋白质组学方
端粒替代延长（ALT）是一种不依赖端粒酶、基于重组的途径，部分癌症采用该途径。研究人员先前建立了源自小鼠胚胎干细胞（mESCs）的两种不同类型ALT存活细胞，其特征分别为独特的非端粒插入序列（I型）或典型端粒重复序列（II型）。本研究采用端粒特异性蛋白质组学方法阐明这两种ALT类型不同的端粒维持策略。研究人员鉴定了富集于I型与II型ALT端粒的差异蛋白质组图谱。ICE1是Little Elongation Complex（LEC）的一个组分，特异性招募至I型ALT端粒，在此支持含端粒重复序列RNA（TERRA）的转录及端粒维持。相反，丝氨酸/苏氨酸激酶VRK2高度富集于II型ALT端粒，在此调控端粒-核膜相互作用。分别敲低ICE1或VRK2会损害I型和II型ALT mESCs的端粒稳定性。研究结果表明，具有共同mESC起源的细胞可采用不同的分子机制维持端粒完整性，凸显了ALT端粒维持的机制异质性。
端粒是位于染色体末端的核蛋白复合体，维持基因组稳定性。由重复DNA序列及相关蛋白组成，端粒逐渐缩短，限制真核细胞的复制寿命。虽然临界短端粒通常触发细胞衰老或凋亡，但约15%的人类癌症通过一种称为端粒替代延长（ALT）的不依赖端粒酶的同源重组途径逃避这些过程。ALT也存在于端粒酶缺陷细胞及天然缺乏端粒酶的物种中。
端粒酶缺陷的小鼠胚胎干细胞（mESCs）为评估ALT激活提供了可靠的模型。先前研究鉴定了来源于端粒酶RNA组分缺陷mESCs的两种不同类型ALT存活细胞。尽管两种细胞源自同一亲本细胞系，但它们采用根本不同的端粒维持机制。I型ALT mESCs利用mTALT（ALT小鼠模板）重建端粒，这是一种位于11号染色体亚端粒区域的独特非端粒7.4-kb序列。相比之下，II型ALT mESCs通过典型TTAGGG重复序列维持端粒。重要的是，I型ALT的出现已在多个独立存活细胞中可重复观察到，表明其并非孤立事件；然而，与II型ALT相比的相对频率尚未确定。
与人类ALT癌症不同，人类ALT癌症一致显示C环水平升高，而I型和II型ALT mESCs均缺乏C环水平升高。值得注意的是，尽管尚未鉴定出明确的I型ALT人类对应物，但在其他真核生物中已报道涉及非经典染色体末端维持的类似不依赖端粒酶的存活状态。然而，哺乳动物细胞中I型ALT的分子机制仍知之甚少，特别是含端粒重复序列RNA（TERRA）的调控。
TERRA是从亚端粒和端粒区域转录的长链非编码RNA，已成为人类ALT癌症端粒稳定性的关键调控因子。TERRA水平失调（无论过高或不足）均会破坏端粒维持，凸显其紧密调控的重要性。在I型ALT mESCs中，研究人员先前证明含有mTALT衍生退化重复序列的TERRA转录本丰富且有助于端粒稳定性。转录水平上，I型ALT细胞表现出独特特征：不同于典型TERRA向端粒方向转录，I型ALT细胞产生从端粒向着丝粒方向转录的反向TERRA。相比之下，II型ALT mESCs更接近人类ALT肿瘤，维持典型端粒重复序列并形成ALT相关早幼粒细胞白血病体（APBs）；然而，其未表现出TERRA表达升高。调控这些不同ALT类型中TERRA转录和端粒完整性的分子因子仍不清楚。
本研究利用源自共同祖先的配对pre-和post-ALT mESC系，系统表征了ALT启动和维持过程中端粒相关蛋白质组的变化。基于分离染色质片段的蛋白质组学（PICh）分析，研究人员鉴定了I型和II型ALT mESCs端粒富集的独特蛋白质网络。研究证明转录延伸因子ICE1特异性地在I型ALT细胞中调控TERRA表达，而丝氨酸/苏氨酸激酶VRK2在II型ALT细胞中控制端粒-核膜（NE）相互作用。综上，研究人员鉴定了两种机制不同的ALT程序，并为端粒维持策略的多样性提供了新见解。
结果
ALT mESCs表现出类型特异性端粒相关蛋白质组
研究人员用示意图展示了ALT mESC模型，详细描述了I型和II型ALT细胞从共同端粒酶缺陷祖先的衍生过程。将ALT激活前和激活后的细胞分别命名为I-pre和I-post ALT（I型）及II-pre和II-post ALT（II型）。为证明ALT活性，使用天然FISH定量单链富C端粒DNA（ssTeloC）。与预期一致，I-post和II-post ALT细胞的ssTeloC水平较其pre-ALT对应细胞显著升高。端粒酶阳性HeLa细胞和ALT阳性U2OS细胞分别作为阴性和阳性对照。EdU掺入实验证实post-ALT群体的端粒DNA合成较pre-ALT对照增加。两种ALT类型的端粒Ser33磷酸化RPA2（RPA2 S33P）积累均显著增加，表明ALT活性特征性的复制应激增加。
为检测ALT激活和维持过程中端粒的分子变化，进行了分离染色质片段的蛋白质组学（PICh），随后进行质谱（MS）分析。使用[TTAGGG]
10探针捕获端粒染色质，特异性地富集与典型端粒重复序列相关的蛋白质而非mTALT序列。所有样本中鉴定出超过3,000种蛋白质，其中>450种在端粒显著富集。已知端粒特异性复合体（包括shelterin亚基TRF1、TRF2、RAP1、POT1a/b、TIN2、TPP1和CST亚基CTC1、STN1、TEN1）被检测到，验证了捕获特异性。
富集蛋白的比较分析揭示了两种ALT类型间不同的分子特征。在I-post ALT mESCs中，端粒优先富集转录延伸因子（ICE1、ICE2、ELL、ELP4、AFF4）、转录相关因子（BRWD1、IRF2BPL、MAFG、ZFP280D、ZFP518B）、异染色质调控因子（CTCF、DAXX、HP1BP3、ZDBF2）和BRCA1复合体成员（BRCA1、BARD1、BRCC3、UIMC1、ABRAXAS1）。这一模式与I-post ALT端粒的双重性质一致，其同时表现出抑制性染色质特征和活跃转录。
相反，II-post ALT端粒富集参与范可尼贫血通路（FANCC、FANCD2、FANCG、FANCF、FAAP100）和核膜相关蛋白（EMD、LEMD2、LEMD3、VRK2）的蛋白质。值得注意的是，BLM和RMI2（Holliday连接体溶解的关键介导因子）高度富集，与先前报道的II-post ALT mESCs中BLM–TOP3A–RMI1/2介导的解析机制一致。综上，这些蛋白质组谱证实I-post和II-post ALT mESCs利用根本不同的分子策略维持端粒完整性。
ATRX/DAXX保留将ALT激活与经典功能缺失机制解偶联
尽管ATRX或DAXX的功能缺失突变是人类ALT癌症的标志性特征，但mESCs中的ALT激活不伴有此类遗传改变或整体表达降低。为确定这种独立性是否延伸至端粒定位，研究人员评估了PICh-MS数据集中ATRX和DAXX的丰度。两种蛋白在I-post ALT mESCs中丰度更高且与端粒相关，而在II-post ALT细胞中与其pre-ALT对应细胞相比保持稳定。这些结果证实mESCs中的ALT激活并非由端粒染色质上ATRX/DAXX的缺失驱动。相反，它们的保留以及I-post ALT细胞中潜在富集表明替代机制在ALT激活中发挥作用。ALT活性与ATRX/DAXX缺失的这种解偶联表明其与人类样本中观察到的经典功能缺失模型存在机制差异。
ICE1促进I型ALT mESCs中TERRA的生产性转录
I-post ALT端粒上转录延伸机制的显著富集促使研究人员检测Little Elongation Complex（LEC），其由ICE1、ICE2和ELL组成。由于LEC调控RNA聚合酶II（Pol II）介导的非多聚腺苷酸化RNA转录，其在I-post ALT端粒的富集提示其在调控端粒重复序列RNA（TERRA）中的作用。
研究人员首先确定ALT激活是否改变TERRA转录起点。与先前鉴定性染色体假常染色体区（PAR）为正向TERRA主要来源的研究一致，PAR衍生转录本在I-pre和II-pre ALT mESCs中占主导地位，这一模式在II-post ALT细胞中保持稳定。相反，I-post ALT mESCs未显示向亚端粒正向TERRA转录的转变，而是表现出PAR衍生和亚端粒正向TERRA水平降低。与先前结果一致，I-post ALT细胞的特征是源自mTALT区域的反向TERRA大幅上调，尽管驱动启动子尚未鉴定。
为确定LEC是否直接调控反向转录，研究人员敲低了支架亚基Ice1，这导致mTALT区域Ser2磷酸化Pol II（Pol II S2P）显著积累，表明转录已启动但可能停滞。尽管Pol II积累，RT-qPCR分析显示TERRA转录本显著减少，该表型在Ice2敲低后同样出现。这些观察表明LEC是生产性延伸所必需的，而非初始聚合酶招募所需。
研究人员进一步检测了TERRA水平降低的原因。使用放线菌素D的转录关闭实验排除了RNA稳定性改变的可能性，因为对照和ICE1敲低细胞之间的TERRA衰减动力学相当。研究人员假设转录本减少和停滞Pol II积累并存源于转录-复制冲突（TRCs）。Pol II与PCNA之间的邻近连接实验（PLA）证实ICE1敲低后TRCs显著增加。尽管这些PLA数据反映全局细胞冲突，但特异性端粒异常的出现表明ICE1在端粒的局部作用。因此，研究人员提出ICE1促进TERRA生产性延伸以避免ALT端粒的毒性冲突。值得注意的是，Ice1敲低不影响II-post ALT mESCs中的TERRA水平，证实其调控功能特异于I-post ALT细胞的分子环境。
ICE1介导LEC向APBs和端粒的亚核分布重定位
LEC通常定位于无膜核体，如Cajal体或PML体。研究人员确定ALT激活是否影响定位，发现在I-post ALT mESCs中，ICE2与无端粒PML体、ALT相关PML体（APBs）和单个端粒的共定位显著增加。这伴随着APB频率的增加。有趣的是，I-pre和I-post ALT细胞之间的ICE2总焦点数保持不变，表明这些变化代表LEC的定向空间重分布而非蛋白质丰度的整体增加。
这种空间重组织与PICh分析一致，该分析鉴定了ICE2的同步富集以及PML在端粒关联的增加。这些数据独立验证了LEC向端粒染色质的招募以及I-post ALT状态中APB形成的增强。
为确定支架亚基ICE1是否影响ICE2重定位，研究人员进行了shRNA介导的Ice1敲低。ICE1敲低与ICE2与APBs和端粒共定位减少相关；然而，当以生物重复为统计单元时，这些差异未达到统计学显著性。ICE2总焦点数在Ice1敲低后也显示适度增加，尽管该变化无统计学显著性。这些观察表明ICE1敲低可能影响ICE2的空间分布，但需要进一步研究来确定这种关系。由于ICE1通过桥接ICE2和ELL/EAF亚基作为LEC的结构骨架，其敲低可能损害LEC完整性或亚基组织。
综上，这些结果支持ICE1在I-post ALT细胞中组织LEC的作用，并提示ICE1可能有助于其向端粒和APBs的亚核定位。结合上述转录分析，这些发现与ICE1依赖性LEC组织支持TERRA生产性转录的模型一致。
ICE1是端粒稳定性和ALT活性所必需的
为确定LEC破坏对端粒维持的影响，研究人员敲低Ice1或Ice2并评估所得分子表型。任一亚基的敲低均导致端粒功能障碍诱导灶（TIFs）增加，表现为53BP1与端粒的共定位。相反，当以生物重复为统计单元时，ICE1或ICE2敲低均未显著改变端粒RPA2 S33P水平。然而，q-FISH分析显示，任一因子敲低均显著增加无信号染色体末端频率。中期染色体铺展还显示广泛的染色体融合和类Robertson结构，这是I-post ALT mESCs的特征，为这些端粒缺陷发生的更广泛基因组背景提供了背景。此外，LEC另一组
