昼夜节律调控抗抑郁作用相关分子通路在小鼠前额叶皮层与海马中的日间波动特征研究

《Neuropharmacology》：Molecular pathways implicated in antidepressant actions exhibits diurnal fluctuations in the prefrontal cortex and hippocampus of adult male and female mice

　　

摘要专业翻译 与抗抑郁作用相关的关键分子通路在小鼠体内表现出昼夜节律性调控。日间波动模式在不同靶标、性别及脑区（海马（hippocampus, HC）与前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC））之间具有保守性。cFos、Arc、Nr4a1、Dusp1、Dusp5、Dusp6的mRNA表达在暗期（活动期）达到峰值。TrkBY816与GSK3βS9的磷酸化水平在光照期（非活动期）达到峰值。

论文解读文章

一、研究背景与研究目的

昼夜节律系统调控着生物体内众多呈24小时周期性波动的生化与生理过程。近年来，流行病学与实验研究日益揭示昼夜节律系统与情绪障碍之间存在双向关系：生物节律紊乱可促进抑郁状态的发生，而节律的恢复则在抗抑郁效应中发挥关键作用。抑郁症患者及抑郁动物模型中普遍存在睡眠-觉醒模式、体温、激素分泌（如皮质醇/皮质酮与褪黑素）、情绪、活动及食欲等方面的昼夜节律紊乱。

快速起效抗抑郁治疗，尤其是亚麻醉剂量氯胺酮（ketamine），可在单次或数次给药后数小时内缓解抑郁症状，且其抗抑郁效应远超药物代谢半衰期。氯胺酮及其他抗抑郁疗法已被证实可调节抑郁相关脑区（包括内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）与海马（hippocampus, HC））的神经可塑性。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）受体TrkB（tropomyosin-related kinase B）及其下游通路的激活，被认为是抗抑郁药物诱导神经可塑性的关键机制。在TrkB下游通路中，MAPK（mitogen-activated protein kinase，即细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated kinase, ERK））的激活及GSK3β（glycogen synthase kinase 3 β）的抑制尤为关键。

快速起效抗抑郁药物，包括氯胺酮等药物治疗以及电惊厥疗法和睡眠剥夺等非药物干预，均涉及共同的分子通路。这些治疗急性增强谷氨酸能信号传导，并在成年啮齿动物的mPFC和HC中上调即刻早期基因（immediate-early genes, IEGs；包括Bdnf和Arc）。一氧化二氮（nitrous oxide, N₂O）作为另一种候选快速起效抗抑郁药，同样可增加mPFC中神经元兴奋性标志物，包括ERK磷酸化及Dusp1、cFos、Arc和Bdnf的表达。裸盖菇素（psilocybin）作为一种具有快速抗抑郁潜力的致幻剂，也能急性增加mPFC中Dusp1、cFos和Nr4a1的表达。转录组范围研究揭示了氯胺酮与N₂O在mPFC中对MAPK通路的汇聚性调控，主要影响双特异性磷酸酶（dual-specificity phosphatases, DUSPs；又称MAP激酶磷酸酶（MAP kinase phosphatases, MKPs））如Dusp1、Dusp5和Dusp6的转录，这些磷酸酶是MAPK蛋白的重要负调控因子。

值得注意的是，GSK3β和MAPK也是昼夜节律时钟的公认调控因子，这提示神经可塑性与昼夜节律通路之间存在重叠或交互作用。近期研究将昼夜节律系统视为快速抗抑郁反应的关键潜在因素，其作用可能通过这些共享的细胞内信号级联以及睡眠和相关昼夜节律过程的调控来实现。研究人员通过整合N₂O处理影响的转录本RNA测序数据与小鼠PFC中昼夜表达基因的全基因组研究数据，发现同时受昼夜调控和N₂O调节的转录本中，大多数显著标志物呈现同步化时相。

鉴于快速抗抑郁药效应与昼夜节律调控之间日益增长的关联证据，以及时辰药理学（chronopharmacology）作为增强抗抑郁疗效策略的日益受关注，研究人员提出假设：快速抗抑郁反应所涉及的关键分子通路受到昼夜节律调控。为此，研究人员选取了代表这些通路互补组分的分子标志物：即刻早期基因（cFos、Arc和Nr4a1）作为急性神经元激活的转录读出指标，Dusp基因（Dusp1、Dusp5和Dusp6）作为MAPK/ERK信号通路的负调控因子，以及TrkB、GSK3β和ERK的磷酸化作为神经可塑性与昼夜节律信号通路的组分。研究旨在表征这些分子标志物在成年雄性和雌性C57BL/6小鼠HC和mPFC中的日间波动特征，评估转录本表达和选定信号蛋白磷酸化的节律性，为未来时辰治疗研究的设计提供依据，并强调一天中的时间作为转化抗抑郁研究的重要生物学变量。

二、主要技术方法

研究人员使用8至9周龄C57BL/6JRccHsd雄性和雌性小鼠（购自Envigo，荷兰霍斯特），在12:12小时光照-黑暗循环（光照于上午6时开启，即Zeitgeber Time 0；ZT0）条件下饲养。适应期后，小鼠每隔3小时处死一批（每批n=5），在24小时周期内共生成8个实验组：光照期4组（ZT0、ZT3、ZT6、ZT9）和暗期4组（ZT12、ZT15、ZT18、ZT21）。暗期采集在夜视镜下于黑暗中操作以避免光照暴露。双侧mPFC和HC在冷却盘上快速解剖并储存于?80°C。雌性小鼠在处死后通过阴道细胞学评估动情周期阶段。mRNA表达采用定量实时PCR（quantitative real time PCR, RT-qPCR）检测，以Gapdh和B-actin作为海马样本内参基因，Rplp0作为前额叶皮层样本内参基因。蛋白磷酸化水平采用Western Blot检测，磷酸化蛋白以Vinculin为内参进行归一化。统计分析采用固定24小时周期的余弦分析（cosinor analysis）模型拟合昼夜波动，并扩展模型纳入性别分组因子以评估性别差异。

三、研究结果

3.1 c-Fos、Arc、Nr4a1、Dusp1、Dusp5和Dusp6在小鼠海马和内侧前额叶皮层中日间节律性调控

余弦分析显示，所有选定的转录标志物（c-Fos、Arc、Nr4a1、Dusp1、Dusp5、Dusp6）在HC中均表现出显著的24小时节律性，雄性和雌性小鼠均如此。在mPFC中同样检测到所有标志物的显著节律性。振幅值显示mPFC中的波动较HC更为明显，但整体时相模式相似：光照期（ZT3–6）表达最低，暗期（ZT15–18）表达最高。峰值与谷值时间点的表达水平在多数标志物中存在显著差异。性别比较分析显示，在HC中除cFos外所有标志物的总体拟合24小时表达谱均存在显著性别差异，雌性整体表达水平高于雄性；Dusp6的节律组分在性别间存在显著差异，雌性振幅更高。在PFC中，除cFos和Arc外所有标志物均检测到显著性别差异，同样表现为雌性MESOR值更高；Dusp5和Dusp6的节律组分在性别间存在显著差异，雌性振幅更大。

3.2 TrkB信号通路在海马和内侧前额叶皮层中表现出日间振荡趋势

TrkB^Y816位点磷酸化（pTrkB^Y816）的余弦分析显示，雄性小鼠HC中表达谱接近但未达到统计学显著性（p=0.0576），mPFC中检测到显著节律性（p=0.0416）。雌性小鼠HC中检测到稳健且高度显著的节律性（p<0.0001），而mPFC中虽呈现相似日间模式（光照期pTrkB^Y816水平较高），但振荡幅度不足以达到统计学显著性（振幅=11.21；p=0.1837）。尽管统计支持在不同脑区和性别间不一致，但观察到的时相模式提示两个脑区和性别中pTrkB^Y816存在相似的日间波动，光照期磷酸化水平较高，且多数情况下峰值（ZT3-6）与谷值（ZT15）时间点的比较具有显著性。

3.3 GSK3β和ERK磷酸化在24小时周期中的模式

GSK3β在Ser9位点的磷酸化（pGSK3β^S9）作为激酶活性的反向指标（pGSK3β^S9越高表示激酶活性越低）。雄性小鼠HC中余弦分析显示趋向显著（p=0.0667），mPFC中未达显著（p=0.1786）。雌性小鼠中昼夜节律性得到更明确的支持，HC（p<0.0001）和mPFC（p=0.0005）均达到稳健统计学显著性。与pTrkB相似，GSK3β磷酸化水平在光照期达到峰值，峰值（ZT3-6）与谷值（ZT15）时间点之间存在清晰且显著的差异。ERK1/2在其保守激活环残基Thr202/Tyr204（ERK1）和Thr185/Tyr187（ERK2）位点的磷酸化未显示昼夜节律性（所有p值>0.05）。HC中pERK2^T185/Y187似乎在ZT3达到峰值，而mPFC中在光照期和暗期均趋于升高，提示为非节律性日间波动。pERK1^Thr202/Y204在mPFC中呈现与pERK2相似的模式，但在海马样本中无法检测。

四、讨论总结与结论翻译

讨论总结： 本研究表明，与抗抑郁反应密切相关的多个分子标志物在成年未处理小鼠的HC和mPFC中表现出昼夜节律性调控，且振荡模式在不同标志物、性别和脑区之间高度一致，提示抗抑郁靶标分子存在基础的、保守的节律性调控机制。所有选定转录本（cFos、Arc、Nr4a1、Dusp1、Dusp5和Dusp6）均表现出显著的24小时节律性，其中IEG和Dusp基因的表达在暗期（小鼠活动期）达到峰值，且光照开启（下降）和关闭（上升）后的急剧转变表明这些基因对环境光照线索高度敏感。蛋白磷酸化水平方面，pTrkB^Y816和pGSK3β^S9在光照期（小鼠非活动期）水平较高，与既往关于BDNF/TrkB信号与深睡眠稳态出现相关联的研究一致，也与此前报道的海马pGSK3β在光照期磷酸化较高的日间振荡研究相符。pERK1/2则呈现非节律性波动。性别差异方面，雌性整体表现出更高的转录本表达水平和更明显的蛋白磷酸化时相波动，Dusp6在HC和PFC中均表现出尤为显著的性别差异，支持DUSP6-ERK通路在基础条件下即存在性别依赖性调控。时间因素在抗抑郁研究中长期被忽视，本研究显示关键分子标志物的基因表达和蛋白磷酸化谱随一天中的时间及小鼠活动期变化，这些时相波动可能影响实验读出指标并成为数据解释中的混杂因素，可能造成不同研究间因给药、采样或治疗时间不同而产生的不一致结果。啮齿类夜行性动物与人类昼行性动物在昼夜节律上的对立性进一步限制了转化相关性。峰值窗口（ZT15-18）与小鼠活动期重合，可能为行为测试和治疗给药提供更具生理学和转化相关性的时间窗口。本研究同时纳入两性是重要优势，因为大多数临床前生物医学研究仅关注雄性。

结论翻译： 这项工作证明，抗抑郁反应所涉及的分子靶标受到昼夜节律性调控，在不同标志物、性别和脑区之间具有一致的振荡模式，表明存在基础的、保守的节律性调控机制。光照开启/关闭后表达的急剧转变进一步提示存在显著的日间组分。这些动态模式支持对个体化（如性别特异性）、时间知情治疗策略的需求，并强调时辰药理学作为临床应用的关键考量因素。总体而言，本研究结果强调了将昼夜节律知识整合入神经科学研究的重要性，以及在研究抗抑郁机制和开发新型精神科治疗时考虑日间节律性的必要性。