《New Microbes and New Infections》：A case of infection with a candidate new subtype, tentatively termed M, of human immunodeficiency virus type 1 of group M
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背景：HIV-1的出现估计发生在20世纪20年代左右的刚果民主共和国（Democratic Republic of the Congo, DRC）。只有其M组（group M）呈现大流行特征，目前包含10个已确立的亚型（subtypes）。本研究描述了一个近乎
背景：HIV-1的出现估计发生在20世纪20年代左右的刚果民主共和国（Democratic Republic of the Congo, DRC）。只有其M组（group M）呈现大流行特征，目前包含10个已确立的亚型（subtypes）。本研究描述了一个近乎完整的HIV-1基因组，该基因组符合候选新亚型的定义。方法：研究人员采用自行设计或商业化的PCR引物从血液中扩增HIV-1 DNA。测序使用了Sanger测序和下一代测序技术（包括Oxford Nanopore和Illumina平台）。生物信息学分析使用了Samtools、Minimap2、Viroscore、Bootscan、IQ-TREE、iTOL、MEGA12和Nextclade等工具。结构分析使用了Mutate、HyperChem和Molegro Molecular Viewer。结果：患者来自刚果民主共和国。CD4+ T细胞计数波动于351-2,394/mm3之间，血浆病毒载量初始为5.0 log10 copies/mL，在接受抗逆转录病毒治疗后达到检测不到水平。获得的近乎全长基因组（PZ307881）与10个已确立亚型基因组的平均核苷酸差异为12.7%（范围11.9%-13.7%），而这10个已确立亚型之间的平均差异为12.6%（范围10.0%-13.7%）。系统发育树呈现星状拓扑结构。未发现重组事件。未检测到天然抗逆转录病毒药物耐药性。与B亚型逆转录酶（reverse transcriptase, RT）相比，候选新亚型的RT结构表现出轻微变化，可能改变其持续合成能力，并可能促进更高的遗传多样性。结论：这些数据支持一个候选的HIV-1 M组新亚型，研究人员暂将其命名为M，以待正式的分类学命名。结果表明HIV-1的多样性尚未被全面解析，并与刚果民主共和国作为HIV-1/M大流行中心的认识一致。该发现需要通过在其他流行病学无关联的个体中检测到该候选新亚型来进行进一步研究，以确认这一暂定新亚型，并评估其流行病学、基因型和表型特征。
研究背景与目的
人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）目前包括HIV-1和HIV-2两种类型。HIV-1的出现估计发生在20世纪20年代的刚果民主共和国（Democratic Republic of the Congo, DRC），其M组（group M）是唯一呈现大流行的谱系，目前包含10个已确立的亚型（subtypes），分别标记为A-D、F-H、K-L，此外还有9个亚亚型（sub-subtypes）。新亚型的认定需要至少三个来自不同流行病学无关联个体的病毒株或完整基因组。最近一次被认定的HIV-1 M组新亚型是L亚型。尽管已有大量研究，但HIV-1的多样性仍未完全阐明，尤其是在刚果民主共和国这一大流行中心地区，仍有罕见的亚型在持续传播。本研究旨在描述一例来自刚果民主共和国的女性患者体内发现的、符合多项候选新亚型标准的HIV-1基因组。
研究方法
研究人员从一名来自刚果民主共和国的女性患者的外周血单个核细胞残留样本中提取HIV-1 DNA。测序采用了Sanger测序、Oxford Nanopore和Illumina下一代测序技术。基因组组装和分析使用了BWA-MEM、Samtools、MEGAHIT等工具。比较基因组学和系统发育分析使用了Los Alamos国家实验室（LANL）HIV序列数据库中的10个已确立亚型代表性基因组，以及通过BLAST检索获得的GenBank中排名前十的非冗余序列。遗传距离矩阵使用BioEdit构建，系统发育重建使用IQ-TREE 3和Nextclade进行，并通过iTOL或MEGA12可视化。重组分析通过SimPlot进行bootscanning。抗逆转录病毒药物基因型耐药性评估使用了法国国家艾滋病研究机构和斯坦福大学HIV耐药性数据库的算法。HIV-1嗜性预测使用了geno2pheno工具。逆转录酶（RT）的分子建模模拟使用了Swiss PDB的Mutate工具和HyperChem软件。
研究结果
病例报告：患者为一名来自刚果民主共和国的六十多岁女性，于1989年被诊断出HIV-1感染，输血被认为是传播途径。治疗开始时CD4+ T淋巴细胞计数为351/mm3，随后CD4计数在406/mm3至2,394/mm3之间波动。血浆HIV-1 RNA在治疗开始时为5.03 log10 copies/mL，自2008年起在接受规律病毒学监测的情况下保持检测不到水平。2023年的HIV-1蛋白印迹试验仅显示对包膜蛋白和衣壳蛋白的反应性。
序列分析、比较基因组学和突变模式：获得的近乎全长共有基因组（GenBank编号PZ307881）长度为8,950个核苷酸，覆盖了B亚型参考基因组K03455的92%。该基因组与10个已确立亚型参考基因组的平均核苷酸差异为12.69%，而10个已确立亚型之间的平均差异为12.64%，两者高度相似。系统发育分析显示，该候选新亚型的共有基因组序列形成了一个独立的分支，整体呈星状树拓扑结构。最接近的已确立HIV-1亚型是J亚型，bootstrap值为99%。Nextclade将该候选新亚型识别为“其他进化枝”。基于八个基因组片段独立构建的系统发育树也显示出整体的星状拓扑结构，且候选新亚型序列形成独立分支。Bootscan分析未发现该基因组的重组事件。未检测到天然存在的抗逆转录病毒药物耐药性氨基酸突变，但在一例奈韦拉平治疗失败期间短暂检测到Y181C置换，以及在阿扎那韦/利托那韦治疗失败期间检测到I84V置换。HIV-1嗜性被预测为R5。基于可用序列，该候选新亚型沿HIV-1基因组的平均样本内多样性为1.61%。
HIV-1逆转录酶的分子建模：研究人员将候选新亚型RT与HIV-1 HXB2酶进行了比对，发现40个突变位于蛋白质表面。这些突变被预测会导致RT环区发生结构性变化，例如由氨基酸S134-P140或K281-T296形成的环区。观察到F130-P150扣环的闭合和K281-P294环区的普遍扁平化。此外，对应于RT“手指”亚域中功能重要的β3-β4环区的N57-D76区域的变化，与RT“手指”和“手掌”之间更大的空间相关。突变还被预测会改变表面静电势，但配体相互作用区域仍保持全球电正性。值得注意的是，候选新亚型的RT-配体相互作用能从-646 kJ/mol略微降低至-512 kJ/mol，这是由于参与配体相互作用的氨基酸从15个减少到7个所致。
讨论与结论
本研究的分析强烈表明，从一名来自刚果民主共和国的患者体内鉴定出的HIV-1毒株属于HIV-1 M组内的一个候选新亚型。该候选新亚型的序列与已确立亚型的差异程度，与已确立亚型之间的差异程度相当，并且未检测到重组事件。研究人员暂时将该候选新亚型命名为“M”，遵循了之前已确立的L亚型和字母顺序，同时注意到字母M的使用可能存在命名上的歧义，因为它已经用于指代HIV-1的主要大流行组。该候选新亚型属于最罕见的M组亚型之一，与F、H、J、K和L亚型并列，每种占全球HIV-1感染的不到1%。这进一步表明刚果民主共和国是HIV-1大流行的中心。研究人员通过下一代测序观察到血液样本中病毒序列存在显著的多样性，但每条序列与GenBank中所有其他可用序列以及参考亚型序列均高度分歧。关于罕见HIV-1亚型感染者的蛋白印迹谱数据非常有限，研究中观察到的缺乏针对Pol蛋白的抗体反应性可能部分归因于抗原性差异蛋白导致的亲和力降低，也可能是由于长期感染导致的总体弱抗体反应。对于该候选新亚型基因组中不存在天然耐药突变的解读应谨慎，但这与其他罕见亚型乃至全球最流行亚型的观察结果一致。基于分子建模，研究人员预测该候选新亚型的氨基酸突变可能导致RT环区的轻微变化，包括直接参与酶持续合成能力的β3-β4环区。配体相互作用区域的静电势保守性与RT的基本功能一致。相互作用能的降低不会损害酶-底物复合物的形成，但可能调节其稳定性，从而影响RT特性，特别是持续合成能力。降低的RT持续合成能力可能通过促进酶-底物复合物的解离/再结合事件，增加模板转换频率，从而促进遗传重组。然而，这些假设完全源于计算机分子建模，需要体外生化验证。总之，现有数据表明HIV-1的多样性尚未被全面解析，与先前关于刚果民主共和国是HIV-1 M组大流行中心和罕见HIV-1亚型持续传播的地理区域的证据一致。此外，研究结果促使进一步开展研究，主要在刚果民主共和国，以获得更多基因组，尝试通过在至少两名与本病例无直接流行病学关联的个体中检测到该候选新亚型来确认其暂定分类地位和命名，并确定其流行率及潜在的基因型和表型特征。
