低剂量多柔比星（Dox）脉冲预处理人诱导多能干细胞（iPSCs）致全基因组转录重编程并持久损害iPSC衍生心肌细胞（iCMs）线粒体与收缩功能

《npj Regenerative Medicine》：Priming of human iPSCs with doxorubicin causes genome-wide transcriptional reprogramming and functional impairments in iPSC-derived cardiomyocytes

　　

多柔比星（Doxorubicin，Dox）介导的干细胞或心肌细胞损伤如何促进心脏毒性（cardiotoxicity）和心脏再生尚不清楚。利用人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，iPSCs）模型及相应的iPSC衍生心肌细胞（iPSC-derived cardiomyocytes，iCMs）发现，iPSCs对单次短脉冲Dox处理比iCMs敏感得多。在Dox处理的iPSCs中检测到主要线粒体损伤，如线粒体碎片化增加、线粒体膜电位丧失、ATP水平降低和线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）组织改变，但未检测到活性氧（reactive oxygen species，ROS）形成增加、核DNA损伤反应或凋亡。全基因组转录组分析显示，对Dox的转录反应存在重大差异，包括调节细胞稳态和能量代谢的基因下调。在iPSC阶段暴露于Dox（此处称为预处理，priming）使iCMs全局转录景观向心肌再生、能量代谢、肌肉收缩减少和纤维化增加转变。在功能上，预处理使iCMs“记住”这种早期Dox处理，导致ATP水平降低、mtDNA组织改变以及收缩力受损和振荡性Ca²⁺处理异常。研究人员提出，Dox诱导的干细胞线粒体功能障碍和转录预处理持久改变其后代的心脏和生物能量特性，可能损害分化后的再生能力。这可能对接受化疗的儿童和青少年特别相关。

多柔比星（Doxorubicin，Dox）广泛用于实体瘤和血液恶性肿瘤化疗，但可导致急性和慢性心脏毒性，限制临床应用。其表现与累积剂量和给药时间有关，个体差异大，儿童、女性和老年患者易发生晚发心脏问题。机制尚未明确。心肌细胞终末分化，成人心脏再生能力低。线粒体在Dox心脏毒性中关键，但以往体外研究多用高剂量长期处理，不能完全反映患者快速输注后1 h内血浆浓度降至25–250 nM的临床情况。研究人员假设线粒体功能障碍既损伤现有心肌细胞，又抑制心脏再生，尤其影响对Dox敏感的干细胞/祖细胞，从而导致长期心脏毒性。为此，研究人员建立人iPSCs及iCMs模型，用2 h低剂量Dox脉冲处理，分析iPSCs及其分化后代的线粒体、转录组和功能后果。研究发现iPSCs对Dox高度敏感，IC₅₀约35 nM，而iCMs IC₅₀约512 nM。低剂量Dox不引起明显ROS、核DNA损伤反应或凋亡，却导致iPSCs线粒体碎片化、膜电位丢失、ATP下降和mtDNA核仁组织改变，并广泛下调细胞稳态和能量代谢基因。在iPSC阶段处理（priming）使iCMs持久转录重编程，纤维化增加，心肌再生、能量代谢和收缩相关基因抑制；功能上ATP降低、mtDNA组织改变、收缩力和Ca²⁺振荡受损。研究表明干细胞早期暴露于基因毒性药物可持久改变其心肌后代，可能解释儿童化疗后长期心脏毒性。

技术方法概括：研究人员使用人胎儿来源iPSC系iPS (IMR90)-4（WiCell；WISCi004-B）及Alstem来源iPSC11、iPSC12，按化学定义方案分化为iCMs。关键技术包括：2 h Dox脉冲处理及恢复，MTT和SRB测活力，RT-qPCR，免疫印迹和免疫荧光，活细胞共聚焦检测线粒体形态、膜电位和mtDNA核仁，透射电镜，BN/CN-PAGE，Seahorse呼吸分析，CellTiter-Glo测ATP，全基因组RNA-seq，Fast AiryScan Ca²⁺成像和Cardiovision搏动分析。小鼠样本来自合作者Prof. Dr. Gerhard Fritz和Dr. Christian Henninger前期研究；公共数据来自ARCHS4及Luo et al.等。

结果部分：1 人iPSCs对单次多柔比星脉冲处理高度敏感：通过2 h Dox后48 h MTT和SRB，以及多个iPSC系，IC₅₀约35 nM；多能性标志物POU5F1、NANOG、SOX2和Ki-67增殖标志物无明显变化。2 轻度多柔比星脉冲处理不足以诱导主要DNA损伤反应或凋亡：通过γH2AX、53BP1、ATM/pATM免疫检测和PARP、Caspase 3免疫印迹，低剂量Dox未显著诱导DNA双链断裂反应或凋亡，阳性对照Eto和staurosporine有效。3 多柔比星诱导的iPSCs线粒体碎片化伴随线粒体膜电位丧失：MitoTracker和TMRM活细胞共聚焦显示5 nM即增加碎片化，18 nM增加OPA1加工，48 h后膜电位持续降低。4 多柔比星脉冲处理iPSCs损害线粒体呼吸和ATP形成：Seahorse显示氧消耗率（oxygen consumption rate，OCR）、最大呼吸和ATP产生下降，CellTiter-Glo显示ATP降低约20%；ROS、线粒体嵴、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）复合物组装和活性未显著改变，并发现iPSCs存在OXPHOS超复合物。5 多柔比星脉冲处理调节iPSCs线粒体基因组组织：α-DNA共聚焦显示核仁数减少、5 nM核仁尺寸减小，qPCR显示mtDNA拷贝数仅中度非显著增加，TFAM和Twinkle蛋白不变。6 人多iPSCs多柔比星脉冲处理导致调节细胞稳态和代谢的基因表达重大变化：RNA-seq发现753个基因上调、519个下调；下调基因富集细胞稳态、胞质翻译、丙酮酸代谢等，HK1、PDK1、PGM1、PDHB、HIF1A、LIN28A、SOX4等下降。7 iPSC衍生心肌细胞（iCMs）对多柔比星显示出比iPSCs强得多的抗性：化学定义分化成功，iCMs自发收缩并表达TNNT2、NKX2-5、Myh6、GATA4；iCMs IC₅₀约512 nM，远高于iPSCs。8 iPSCs中多柔比星脉冲处理损害iCMs中mtDNA核仁组织和ATP形成：ATP检测、α-DNA成像和Seahorse显示primed iCMs ATP降低、核仁数增加和尺寸减小；最大呼吸等有趋势。9 对多柔比星脉冲处理的转录反应揭示iPSCs与iCMs之间能量代谢的重大差异：RNA-seq显示iPSCs特异差异表达基因更多；iCMs上调胚胎形态和肾发育，下调心肌发育和收缩；糖酵解和OXPHOS基因呈相反反应；iPSCs所有13个mtDNA编码基因上调。10 iPSCs中单次早期Dox脉冲处理引起iCMs转录适应与心肌再生受损相关：iCM_Dox_Mt对比对照，233个上调、193个下调；上调血管生成、细胞迁移、细胞外基质/纤维化，DCN、WT1、FLNA、BNC2等；下调心肌组织发育，NKX2-6、RYR1、ANKRD1、ACTN3等；公共小鼠数据一致。11 iCMs脉冲处理导致促进凋亡的转录适应：晚期处理共享基因少，25个共享，12个上调、13个下调；上调凋亡过程，FAS、CDKN1A、BAX。12 iCMs对多柔比星的转录反应受iPSCs早期Dox脉冲处理影响，导致能量代谢和肌肉收缩通路抑制：双处理特异300个基因，164个上调、136个下调；上调ERK1/2、p53介导信号、细胞运动等，CDK1、PPM1D、SNAI2、SOX9；下调能量代谢、肌肉系统和收缩，HK1、COX5B、UQCRC1、NDUFS2、NDUFS8、NKX2-5、ATP1B1、TRDN。13 Dox脉冲处理通常伴随iCMs中心肌形成受抑的转录适应：所有处理共同差异表达基因仅35个；下调基因富集肌原纤维组装、横纹肌细胞发育、心脏收缩，MYH6、NEBL、MYL9下调。14 分化前iPSCs多柔比星脉冲处理导致跳动iCMs功能变化：Cardiovision显示早期和双处理降低搏动频率；Fluo4-AM Fast AiryScan显示早期处理增加Ca²⁺峰数、缩短峰间期和释放时间，晚期处理无显著Ca²⁺影响；SRB未显示显著生存变化，primed略增敏感。

讨论部分总结：该模型可剖析低剂量Dox在分化不同阶段的作用。新发现包括：iPSCs比iCMs敏感；低剂量主要损伤线粒体而无ROS、DNA损伤反应或凋亡；iPSCs和iCMs转录反应不同；priming持久重编程，抑制心脏再生、促进纤维化；功能上ATP、mtDNA、收缩和Ca²⁺异常。与高剂量研究不同，低剂量不诱导凋亡和DNA损伤反应。线粒体是主要靶点，mtDNA核仁重塑，OXPHOS超复合物在iPSCs中首次显示。priming有部分hormesis样保护，如ATP、最大呼吸和形态，但对收缩和Ca²⁺不良。晚期处理促凋亡。儿童心脏心肌细胞更新率较高，干细胞池敏感，可解释晚发心脏毒性。未来需动物和人类数据进一步研究。

研究结论翻译：总体而言，研究人员证明即使轻度Dox脉冲处理iPSCs也与持久线粒体功能障碍和转录重编程相关，影响分化后心肌细胞功能。人iPSCs被引入作为敏感细胞模型系统，用于研究Dox暴露后易感过程。除处理时间点外，iCMs脉冲处理显示心脏功能和纤维化变化，得到功能和转录组数据支持。研究结果强调暴露时机重要性，提示干细胞区室对基因毒性应激特别脆弱，具有在心脏分化后表现的长期后果。由于Dox是不同年龄组最常用化疗药之一，问题在于这些持续变化是否导致常见副作用。尽管关于心脏损伤区再填充细胞来源和促进心脏再生驱动因素仍有讨论，但存在某种多能心脏或非心脏干细胞或一部分心肌细胞去分化再分化并促进心脏再生。研究人员提出，这些多能细胞中任何一种对Dox影响线粒体功能的敏感性增强，可能促进尤其儿科患者不良副作用表现。因此，未来需要基于iPSC模型以及动物和人类数据研究，以解读不同类型干细胞在初始暴露于亚致死剂量Dox或其他基因毒性物质后如何在体内转录预处理，以及这如何影响线粒体功能、心力衰竭和心脏再生。