八子补肾方通过激活AMPK-Sirtuins轴与髓系免疫重置逆转慢性不可预测轻度应激（UCMS）诱导的炎性衰老

《Exploration》：Reversal of Chronic Stress-Induced Inflammaging by Bazi Bushen Formula Through AMPK-Sirtuins Axis Activation and Myeloid Reset

　　

慢性应激可能加速衰老并增加年龄相关疾病风险。然而，其潜在机制和器官特异性仍不清楚。研究人员利用12个月不可预测慢性轻度应激（unpredictable chronic mild stress, UCMS）小鼠模型，揭示慢性应激显著加剧系统性炎症（systemic inflammation），导致广泛组织损伤和寿命缩短。多组织整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析提示，淋巴细胞减少和髓系细胞扩张是共同特征。肺和肾表现出显著应激反应，包括表观遗传失调和线粒体功能障碍。β-烟酰胺单核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide, NMN）和复方药物八子补肾（Bazi Bushen, BZBS）均有效缓解UCMS诱导的衰老表型。BZBS恢复免疫系统稳态并降低多种组织中的应激/炎症水平。BZBS组分—五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.）和蛇床子（Cnidium monnieri (L.) Cusson）—中的生物活性化合物通过激活AMPK-SIRT-PGC-1α信号改善线粒体功能。本研究强调对慢性应激进行早期干预以预防或延迟年龄相关疾病的重要性，对旨在促进健康衰老的公共卫生策略具有重要意义。

慢性应激在现代快节奏社会中日益普遍，其不仅损害心理健康，还可增加年龄相关疾病风险并加速表观遗传衰老。人类队列研究已将长期压力与DNA甲基化衰老时钟和免疫衰老标志关联。现有证据提示下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴失调、自主神经系统失衡、端粒损耗和氧化应激积累参与早衰表型。慢性应激与炎症相互作用可导致低度炎症，并推动“炎性衰老”（inflammaging）自我强化循环。然而，关键空白在于：应激如何跨器官差异性重编程免疫与表观遗传网络，以及这些效应是否可逆；药物干预能否缓解慢性应激诱导的衰老表型。八子补肾（Bazi Bushen, BZBS）为专利复方中药，整合八种药用植物种子和长寿草药，既往显示广泛抗衰老特性，但其逆转应激诱导功能衰退的疗效及活性成分不明。为此，研究人员采用11月龄C57BL/6小鼠，通过12个月UCMS整合噪声、昼夜节律紊乱和不良居住条件，模拟现代社会应激；该年龄对应人类中年且基线衰老表型少，便于分离应激加速效应。该研究发表于《Exploration》。

研究人员采用12个月UCMS小鼠模型，样本来自北京华阜康生物科技有限公司：125只雌性和126只雄性11月龄C57BL/6小鼠，另设6只4月龄年轻雄性对照；随机分为对照、模型、NMN（200 mg/kg/d）、BZBS高剂量（2 g/kg/d）和低剂量（1 g/kg/d）组，经历10种每日轮换轻度应激。关键技术包括三室社交、Barnes迷宫、握力/转棒、衰弱指数（frailty index, FI）评估，脑MRI和组织病理，多组织单细胞RNA测序（脑、小肠、肾、肺、外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）），简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）及表观年龄，超高效液相色谱/质谱（UPLC/MS）药代、网络药理学与分子对接，生物膜层干涉（biolayer interferometry, BLI）、细胞热位移实验（cellular thermal shift assay, CETSA）、Western blot、siRNA敲低、Seahorse及线粒体ROS/膜电位检测。

3.1 慢性应激加速多系统衰老和寿命下降，抗衰老治疗可改善。通过12个月UCMS，应激小鼠血清醛固酮升高、体重下降，三室社交显示社交新颖偏好降低，Barnes迷宫空间记忆下降，转棒和握力降低，FI升高，死亡率增加。MRI显示白质萎缩，肠长度、肌肉和脂肪比例下降，多组织H&E/Masson显示表皮增厚、绒毛萎缩、肌纤维紊乱、脂肪细胞萎缩、肾小管扩张、心肺结构损伤和炎症浸润。NMN和BZBS不同程度缓解，高剂量BZBS在降低FI、死亡率和延长寿命方面优于NMN。

3.2 慢性应激在单细胞分辨率诱导髓系-淋系失衡和亚群偏移。对脑、小肠、肾、肺和PBMCs进行scRNA-seq，获得297,944个高质量转录组，注释51种主要细胞类型。应激后免疫细胞总比例变化不大，但髓系/淋系比例失衡，淋系细胞包括B细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞和T细胞显著减少，PBMCs和小肠初始CD4⁺和CD8⁺ T细胞减少，肾、肺和PBMCs髓系细胞增加，巨噬和中性粒增加。BZBS恢复淋系-髓系平衡；免疫荧光证实模型组M1巨噬（CD80⁺）增加，M2巨噬（CD206⁺）和B细胞（CD19⁺、CD20⁺）减少，BZBS和NMN逆转。siAge免疫衰老时钟显示模型组免疫衰老，BZBS降低。B细胞亚群中C0早期分化亚群耗竭、肺特异C6几乎丢失、过渡态C2扩增，BZBS恢复C0和肠组织驻留C4/C5。巨噬C3/C4/C6促炎扩张，中性粒C3积累，BZBS正常化。

3.3 组织特异性转录程序驱动慢性应激加速的炎性衰老。细胞通讯分析显示免疫细胞主导异常信号网络，BZBS几乎完全逆转应激导致的免疫-体细胞互作异常。qPCR证实NF-κB、TNF-α、IL-6、P16^INK4a、P21和P53等多组织上调，高剂量BZBS抑制，BZ-low和NMN改善较弱。AUCell显示UCMS在所有样本和多数细胞亚型中升高炎症，尤其肺AT2和成纤维细胞、肾PT和成纤维细胞、脑神经元/小胶质/CHP细胞、肠中性粒/干细胞。BZBS降低PBMCs整体炎症并逆转肺AT2、成纤维和SMC炎症。应激差异基因在肺和肾最多，PBMCs应激评分高；上调基因富集固有免疫、白细胞活化和凋亡，下调富集适应性免疫、抗原加工提呈和细胞黏附。五器官共有73个基因，如Apoe、Mt1上调，Cdkn1a（P21）上调，B2m、Ifi27l2a和H2家族下调。BZBS降低应激水平，尤其肺和肾。

3.4 组织和细胞衰老异质性多维表征。将应激差异基因与衰老基因集交集定义SA-DEGs。肺和PBMCs的SA-DEG数量最高，脑尽管总应激DEG较少但衰老签名重叠比例最高（86.7%），肾和PBMCs衰老评分最高。肺纤毛细胞、间皮细胞、基底细胞、AT2和成纤维细胞含大量SA-DEGs；肺干细胞、B细胞、巨噬和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞衰老评分升高。衰老模式组织特异：肺和肠CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞衰老增加，CD4⁺记忆T细胞在PBMCs/肾降低而肠升高，B细胞泛组织衰老放大。BZBS逆转的BRA-DEGs在肺绝对数最多，PBMCs细胞校正后最多，肠总数和BZBS特异DEG最多，脑比例最高。衰老hallmark主要与线粒体失调、表观改变和衰老基因相关；肾PT、肠SC/ECC和多数免疫细胞几乎具全部衰老特征。模型组多器官脂质和蛋白过氧化物高，GSH耗竭、SOD活性受损，BZBS减轻；肺巨噬mtROS升高，BZBS降低。肝脏RRBS显示全基因组甲基化增加、表观衰老加速，BZBS显著逆转。

3.5 BZBS通过AMPK激活化合物对抗线粒体应激。大鼠口服BZBS后血浆检测23个原型，脑检测5个原型，主要来自五味子、蛇床子等。CTX星形胶质细胞和RAW264.7巨噬细胞模型中，Osthole、Schisandrin和Schisandrin B剂量依赖改善线粒体功能障碍，抑制mtROS、恢复膜电位；Osthole增强线粒体呼吸，Osthole与Schisandrin B协同抑制mtROS。RAW264.7中Osthole、Schisantherin A和Schisandrin B清除mtROS，后两者减轻辐射诱导基因组不稳定。联合治疗优于单药。与NMN和ABT-263比较，BZBS和NMN降低mtROS和γH2AX，ABT-263主要清除衰老细胞。网络药理学识别414个共同靶点，富集PPARGC1A（PGC-1α）、PRKAA2（AMPK）和SIRT1。Compound C拮抗保护；AMPKα₁或AMPKα₂敲低减弱保护。分子对接和BLI证实与AMPKα₁/α₂、SIRT1、SIRT3、SIRT6结合，CETSA显示热稳定。化合物增强AMPK活性，AMPK抑制逆转PGC-1α和SIRT1核转位；BZBS小鼠肺组织p-AMPKα/总AMPK增加，SIRT1、SIRT3和PGC-1α上调。表明Schisandrin衍生物为主要活性成分，经AMPK-SIRT-PGC-1α轴改善应激诱导线粒体功能障碍。

讨论指出，传统时序衰老模型耗时且机制简化，UCMS模型以病理“时间压缩”在限定时间内重现多系统交互，揭示器官易感。UCMS与加速表型衰老存在因果联系，表现为功能衰退、FI升高和生存曲线压缩，多组织病理显示系统性组织完整性侵蚀，炎症细胞浸润、炎症因子和衰老标志上调，提示系统性低度炎症和衰老细胞积累是长期UCMS加速衰老的突出特征，与炎性衰老密切相关。免疫衰老特征包括淋巴细胞产生下降、适应性免疫下降和炎症增加；UCMS导致广泛免疫衰老，髓系增加、淋系减少、应激/炎症/衰老基因上调，B细胞耗竭。髓系细胞广泛影响组织驻留干/体细胞，是中心驱动因素。先前研究提示UCMS诱导骨髓造血干细胞髓系偏斜，但全身免疫失调起源仍需研究。免疫功能障碍可通过巨噬细胞NOX2依赖途径升高线粒体ROS，以及中性粒MPO生成次氯酸放大氧化损伤；肾UCMS巨噬mtROS升高，BZBS逆转。脑因血脑屏障免疫浸润少，但转录向衰老相关通路偏移；肺作为开放器官，免疫重塑和干/体细胞改变显著，可能是衰老传播枢纽。73个共有应激基因主要与代谢病、癌症、免疫反应和氧化应激调控相关。药物干预显示BZBS和NMN恢复线粒体功能、减少DNA损伤，ABT-263仅清除衰老细胞而不改善代谢参数。BZBS在多个衰老参数上优于NMN，可能因其同时靶向Sirtuin激活、AMPK和PGC1α刺激及基因组稳定等多节点。多成分协同：Schisantherin A促进基因组稳定、Schisandrin B增强线粒体、Osthole缓解氧化应激，联合抗衰老效果优于单药。体外敲低表明线粒体保护需要功能性AMPK，但体内髓系条件敲除仍待验证。局限性包括小鼠模型不能完全复制人类衰老、仅分析五个主要组织、候选基因缺乏体内验证、仅单一抗衰老药物阳性对照、预防性干预不同于临床治疗场景。

研究结论翻译：总之，该研究表明UCMS小鼠模型表现出加速衰老特征，包括全身范围组织损伤和炎性衰老。UCMS通过髓系扩张、淋系耗竭及应激/衰老基因上调触发免疫衰老。BZBS和NMN均改善线粒体功能并减少DNA损伤，而BZBS表现出广泛抗衰老作用。基于观察，研究人员提出免疫功能障碍可能通过巨噬细胞mtROS促进氧化损伤。肺可能是衰老传播枢纽，而BZBS的疗效可能源于多靶点作用。然而，若干局限值得考虑：小鼠模型虽有价值但不能完全复制人类衰老生理；分析聚焦五个主要组织可能遗漏更广泛系统互作；候选基因缺乏体内验证以及仅纳入一种抗衰老药物阳性对照限制了确定性机制解释；预防性干预方案不同于年龄相关症状出现后治疗性临床场景。这些考虑指出未来转化研究的重要方向。