基于NO的STING激动剂纳米佐剂联合ICD衍生膜抗原激发强效抗肿瘤免疫

《Exploration》：A Nitric Oxide–Based STING Agonist Nanoadjuvant With ICD-Derived Membrane Antigens Unleashes Robust Antitumor Immunity

　　

尽管纳米疫苗开发已取得显著进展，其疗效仍受抗原提呈不良、抗原库有限和T细胞初始激活欠佳所限。多聚肌苷酸-多聚胞苷酸（POLY(I:C)）等免疫佐剂通过促进树突状细胞（DC）成熟和刺激固有免疫发挥抗肿瘤效应，但其疗效受限于抗原提呈细胞（APC）摄取差和CD8⁺ T细胞反应弱。在此，研究人员提出一种新型佐剂策略，利用生物活性气态分子一氧化氮（NO）上调主要组织相容性复合体I类分子（MHC-I）并增强DC交叉呈递，从而协同改善POLY(I:C)的佐剂疗效。研究人员开发了纳米疫苗Im@NOnanoPL，将DOTAP、NOC-18和POLY(I:C)预组装复合物共包封于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）壳中，进一步用DSPE-PEG2000修饰，并用免疫原性细胞死亡（ICD）衍生的肿瘤膜伪装，以实现广谱肿瘤抗原覆盖。Im@NOnanoPL引发强健且持久的CD8⁺ T细胞反应，提供近完全预防性保护；与αPD-1疗法联用时，可根除已建立肿瘤并诱导长期免疫记忆。Im@NOnanoPL构成一种新型疫苗平台，整合气体基佐剂与广谱抗原，具有强大转化潜力。

该论文由Shuyu Xu、Yang Song、Tianjiao Zhang、Yan Wang、Mengxin Wang、Xinxin Xie、Qingfeng Chen、Xiaolong Liang等完成，发表在《Exploration》。研究背景：尽管癌症疫苗和纳米疫苗取得进展，其总体疗效仍受抗原提呈差、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）和T细胞初始激活不足限制。POLY(I:C)是TLR3和MDA5激动剂，可促进DC成熟和固有免疫，但皮下给药后诱导强健持久CD8⁺ T细胞反应的能力有限，且疗效依赖DC摄取。多数疫苗依赖少数固定表位，抗原多样性有限，异质性肿瘤中易免疫逃逸。NO是内源性生物活性气体分子，生物相容性高、可自由扩散；本研究发现NO可诱导I型干扰素并上调APC的MHC-I。因此，研究人员假设NO与POLY(I:C)联用能更有效启动淋巴结APC交叉呈递，并构建Im@NOnanoPL，以ICD膜提供广谱肿瘤相关膜抗原，克服人工抗原选择偏倚，增强CD8⁺ T细胞免疫。

关键技术方法（≤250字）：研究人员构建Im@NOnanoPL：将DOTAP、NOC-18、POLY(I:C)预组装复合物共包封于PLGA壳，DSPE-PEG2000修饰，再用顺铂诱导ICD的MC38-OVA或B16-OVA肿瘤细胞膜包覆。采用透射电镜、动态光散射、zeta电位、Griess和RiboGreen法表征；用流式细胞术、共聚焦、IVIS、Western blot、ELISA、ELISPOT、H&E、TUNEL和免疫荧光分析；建立B16-OVA肺转移、MC38-OVA皮下瘤、αPD-1联用和再挑战模型。细胞系包括MC38、MC38-OVA、B16、B16-OVA及DC2.4（由厦门大学Prof. Gang Liu研究组惠赠）；动物为雌性C57BL/6N小鼠（6周龄，北京大学医学部实验动物科学部来源）。

研究结果：
2.1 NO增强DC抗原提呈与免疫刺激功能：骨髓来源树突状细胞（BMDCs）与OVA_257–264（SIINFEKL）肽及NOC-18共培养，流式显示NOC-18（150 μM）在12和24 h显著增加MHC-I_OVA复合物，并浓度依赖上调MHC-I；骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中MHC-I升高、CD206降低，GSNO有类似效应。NOC-18增加CD80⁺CD86⁺ DC比例及TNF-α、IFN-β、IL-6分泌。结论：NO增强DC抗原提呈和免疫刺激活性。
2.2 Im@NOnanoPL设计与表征：顺铂处理MC38细胞诱导ICD，钙网蛋白（CRT）上膜和ATP释放增加，制备Im-vesicles；纳米疫苗包封率POLY(I:C)为98.8%、NOC-18为91.5%；核壳球形约45 nm，水合粒径45–55 nm，多分散指数（PDI）<0.3，包膜后zeta电位低于?20 mV。37°C时Im@NOnanoPL持续释NO，表观半衰期约10.5 h；DC2.4中NO荧光更强。结论：成功构建可稳定递送佐剂、控制释放NO并覆盖个性化抗原的平台。
2.3 体外免疫效应：0–150 μM无显著细胞毒，100 μM不破坏膜和线粒体膜电位；Im@NOnanoPL比m@NOnanoPL更强DC摄取，2 h与溶酶体共定位，6 h溶酶体逃逸；增强MHC-I_OVA和MHC-I，Western blot显示p-TBK1、p-STING升高，激活STING-TBK1-IRF3；与CD3⁺ T细胞共培养，CD8⁺ T细胞CD69⁺、CD25⁺及IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β最高。结论：促进抗原提呈、STING激活和CD8⁺ T细胞激活。
2.4 体内淋巴结靶向和DC摄取：Cy5标记疫苗注射后，IVIS显示Im@NOnanoPL在近端和远端引流淋巴结（dLN）荧光显著高于m@NOnanoPL；6 h器官成像显示淋巴结信号高于心肝脾肺肾；流式显示淋巴结DC摄取更强，并可被CD103⁺CD11c⁺迁移性DC和CD8⁺CD11c⁺驻留DC摄取。结论：通过局部DC迁移和淋巴引流增强淋巴结靶向。
2.5 体内有效免疫反应：健康C57BL/6N小鼠第1、7天接种，14天检测；Im@NOnanoPL组淋巴结肿大最明显，DC MHC-I⁺CD11c⁺较PBS增加2.5倍，成熟DC最高，淋巴结GZMB⁺CD8⁺由约7.0%升至24.8%，IFN-γ⁺由约1.9%升至8.1%，血清IFN-β、IL-1β、IL-6、TNF-α升高；脾细胞经PMA/ionomycin或MC38-OVA蛋白刺激后，Im@NOnanoPL组IFN-γ⁺、GZMB⁺T细胞最高，抗原特异性刺激下GZMB⁺CD8⁺约5.5倍、IFN-γ⁺CD8⁺约3倍于PBS。结论：诱导全面体内免疫反应。
2.6 预防性抗肿瘤效力：用B16-OVA ICD膜个性化疫苗，第1、7、14天三剂接种，末次7天后尾静脉挑战2×10⁵ B16-OVA，第35天评价。Im@NOnanoPL几乎无肺转移结节，H&E显示肺结构保留；淋巴结DC MHC-I和CD80⁺CD86⁺升高，脾CD8⁺中央记忆T细胞（Tcm）增加2.1倍、CD8⁺效应记忆T细胞（Tem）增加1.8倍，CD69⁺CD8⁺T、IFN-γ和GZMB升高。结论：通过初始激活、记忆形成和长期免疫监视实现近完全预防。
2.7 治疗效力联合αPD-1：MC38皮下瘤约70 mm³时随机分组。Im@NOnanoPL单药抑瘤率57%，Im@nanoPL为24%，m@NOnanoPL为28%，αPD-1单药约35%体积降低；联合αPD-1显著抑制肿瘤，50天100%生存。组织学显示广泛坏死、增殖降低、凋亡增加。流式显示联合组肿瘤CD8⁺T增加4.3倍、CD4⁺T增加2.1倍，M1由22%升至53%，M2由25.5%降至7.8%，NK1.1⁺CD11b⁺翻倍，PD-1⁺Tim-3⁺耗竭T由55%降至5.9%，成熟DC和MHC-I升高；IFN-γ和GZMB最高；TME中IFN-β、TNF-α、IL-6、IL-1β分别增加4.48、6.4、7.85、6.25倍。结论：通过激活肿瘤特异性T细胞、逆转耗竭和重塑TME实现协同。
2.8 长期免疫记忆和机制：MC38-OVA模型中，治疗后7天dLN DC MHC-I增加1.6倍、抗原-MHC-I复合物增加1.9倍，成熟DC由约24%升至约52%，GZMB⁺CD8⁺由0.3%升至3.2%，IFN-γ⁺CD8⁺由0.6%升至1.9%。第60天再挑战3×10⁶ MC38-OVA，联合组CD8⁺Tcm由15.8%升至25%，Tem由1.78%升至5.01%，OVA再刺激GZMB⁺CD8⁺较PBS增加4倍，ELISPOT IFN-γ更强，对MC38细胞约49%特异性杀伤，再挑战完全保护且100%生存。结论：建立持久肿瘤特异性免疫记忆。
2.9 生物安全性：200 μg mL^?1无溶血；给药后1、7天血常规无显著改变；18天主要器官H&E无病理异常或炎症损伤。结论：治疗方案下生物安全性良好。

讨论/结论翻译：Im@NOnanoPL纳米疫苗平台体现了一种合理工程化策略，将NO驱动的免疫调节与ICD膜抗原递送协同起来，建立强效抗肿瘤免疫的协调系统。其疗效核心是新型NO增强POLY(I:C)佐剂系统：激活STING-TBK1-IRF3信号轴，表现为p-TBK1和p-STING上调；并增强DC和巨噬细胞中MHC-I介导的抗原提呈。顺铂处理肿瘤细胞来源的ICD膜提供全面内源性抗原库，富含损伤相关分子模式（DAMPs），促进抗原摄取和淋巴结靶向，同时避免人工新抗原选择偏倚。预防模型中，Im@NOnanoPL对B16-OVA肺转移显示近完全保护；与αPD-1检查点阻断联用实现协同治疗，根除已建立MC38-OVA肿瘤并建立持久免疫记忆。总之，Im@NOnanoPL整合NO驱动免疫调节与ICD衍生抗原，其NO增强POLY(I:C)佐剂强健促进CD8⁺ T细胞反应；该简便平台可能扩展到POLY(I:C)之外，为癌症免疫治疗提供广泛适用性和强转化潜力。