肾上腺髓质素2（ADM2）驱动瘤内癌细胞侵袭、血管内渗与转移

《Oncogene》：Adrenomedullin 2 drives intratumoral cancer cell invasion, intravasation and metastasis

　　

癌细胞血管内渗既需要朝向血管的定向侵袭，也需要具备功能的血管作为血管内渗位点。研究人员利用活体视频显微镜技术，鉴定出肽类激素肾上腺髓质素2（adrenomedullin 2，ADM2）是该过程的关键调控因子。ADM2在一群高度侵袭性的癌细胞亚群中选择性上调，这些细胞定位于血管附近并主动驱动血管内渗。敲低ADM2表达可显著损害鸡胚转移模型及体外实验中瘤内癌细胞的侵袭与血管内渗能力。ADM2缺陷型肿瘤表现出血管化减少，从而限制了功能性血管内渗位点的可用性。此外，ADM2缺失抑制了侵袭性转移灶的形成，表明ADM2在转移级联的多个阶段均发挥必要作用。与此一致的是，在小鼠转移模型中靶向ADM2可抑制瘤内大血管的形成并减少转移。综上所述，这些发现确立了ADM2作为肿瘤-血管相互作用的先前未被识别的调控因子，并凸显其作为治疗靶点的潜力，可同时破坏侵袭、血管支持及转移播散。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

转移是一个效率极低的过程，只有一小部分原发肿瘤中的癌细胞能够向血管侵袭、进入血液循环、到达继发部位并建立转移灶。其中研究最少的步骤之一是血管内渗（intravasation），该过程发生在原发肿瘤深部，难以可视化与研究。能够从原发肿瘤发生血管内渗的癌细胞亚群特征仍不完全清楚，这阻碍了对该过程的有效靶向干预。早期研究提示，具备血管内渗和转移能力的癌细胞在原发肿瘤内侵袭速度显著更快，并表现出更强的朝向血管的定向性。此外，具有血管内渗能力的癌细胞倾向于朝向血管腔定向，而无血管内渗能力的细胞则方向紊乱且更易碎裂。癌细胞可以以单细胞或细胞团形式发生血管内渗，而腔内细胞团的形成与更差的转移预后相关。研究人员此前已证明，利用鸡胚绒毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）模型可定量可视化人类癌细胞的血管内渗过程，并发现ATF2报告基因活性高的癌细胞（ATF2^high）能够在原发肿瘤内部及其侵袭前沿主动侵袭，而经典Wnt通路报告基因活性高且ATF2活性低的细胞（cWnt^high/ATF2^low）侵袭能力显著较弱，与CAM血管的相互作用能力也降低。基于此，研究人员提出假设：ATF2^high/cWnt^low表型可鉴定出负责癌症进展中侵袭行为的癌细胞亚群。本研究旨在验证这一假设，并阐明人肾上腺髓质素2（ADM2）肽类激素作为癌细胞瘤内侵袭、血管内渗和转移关键驱动因子的作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用高分辨率活体共聚焦显微镜、比较RNA测序（RNA-Seq）、基因敲低（shRNA）技术、鸡胚CAM转移模型、小鼠异种移植模型及体外微流控血管内渗平台等多种手段，系统研究了ADM2在癌细胞转移级联中的功能。研究发现，ADM2在ATF2^high侵袭性癌细胞亚群中选择性高表达，敲低ADM2可显著抑制多种癌细胞系的瘤内侵袭、血管内渗、血管生成及转移灶形成，确立了ADM2作为肿瘤-血管相互作用关键调控因子及潜在治疗靶点的地位。

三、主要技术方法

研究人员采用了多项关键技术方法：利用活体视频显微镜和共聚焦显微镜在鸡胚CAM模型中可视化癌细胞行为；通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）分离ATF2^high与ATF2^low/7TCF^high细胞亚群并进行比较RNA测序分析；采用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）介导的基因敲低策略；构建体外微流控血管内渗平台模拟剪切应力下的癌细胞侵袭行为；利用小鼠异种移植模型和尾静脉注射实验转移模型评估自发转移和实验性转移；结合公开的TCGA和GTEx数据库进行ADM2表达与预后关联的生物信息学分析。

四、研究结果

1. ATF2^high癌细胞定位于血管周围区域并驱动瘤内细胞侵袭

研究人员利用高分辨率活体共聚焦显微镜观察HT1080双报告基因（ATF2-GFP和7TCF-mCherry）细胞在鸡胚CAM原发肿瘤中的行为。结果显示，ATF2^high癌细胞优先定位于血管周围区域，ATF2/7TCF报告基因信号比值随距血管距离增加而递减。视频显微镜分析表明，ATF2^high细胞沿血管腔快速侵袭，而ATF2^low细胞运动显著较慢且呈随机性。体外实验同样证实ATF2^high细胞迁移速度显著快于7TCF^high细胞。

2. ATF2^high癌细胞驱动肿瘤细胞血管内渗

高分辨率成像显示，与血管壁直接接触的血管周围细胞中大多数为ATF2^high细胞，而7TCF^high细胞与血管直接接触的数量显著较少且常呈碎片化。ATF2^high细胞频繁主动向血管腔内出芽，这是癌细胞血管内渗的起始步骤。完全进入血管腔的癌细胞（无论是单细胞还是多细胞团）全部为ATF2^high细胞。血管内细胞团高度动态，癌细胞在团内移动后随血流剪切力被冲走。值得注意的是，大多数血管内渗事件发生在较大的肿瘤引流静脉中，血管内渗位点的平均血管直径为72.5±43.08 μm，显著大于随机血管的平均直径23.5±28.7 μm。

3. 肽类激素肾上腺髓质素2（ADM2）在ATF2^high癌细胞中过表达且对其血管内渗至关重要

通过FACS分选ATF2^high和ATF2^low/7TCF^high细胞并进行比较RNA测序，研究人员发现ADM2、IAH1和PTCHD1在ATF2^high细胞中显著过表达，而FOSB、C3和TSPAN32在ATF2^low/7TCF^high细胞中显著上调。定量PCR证实ADM2在ATF2^high细胞中表达显著更高，且在ATF2敲低细胞中ADM2表达大幅受抑，提示ADM2可能受ATF2转录因子调控。在HT1080、MDA-231、KHOS和U87等多种癌细胞系中敲低ADM2后，肿瘤血管直径显著减小，癌细胞血管内渗能力显著降低，瘤内侵袭明显减少。此外，ADM2敲低肿瘤中7TCF报告基因活性在全肿瘤范围内升高，血管周围7TCF^high细胞比例显著增加，提示ADM2可能影响ATF2或经典Wnt信号通路。

4. 靶向肾上腺髓质素2功能抑制癌细胞转移级联的多个步骤

在小鼠异种移植模型中，表达scramble shRNA的HT1080细胞形成快速增殖并自发转移至肺和肝的肿瘤，而表达ADM2靶向shRNA的细胞形成的肿瘤生长显著较慢且转移潜力降低。免疫组化分析显示，对照肿瘤高度血管化且存在大量大血管，而ADM2敲低肿瘤血管化程度较低，血管数量和大小均显著减少。ADM2敲低肿瘤中侵袭性ATF2^high细胞比例显著降低。在鸡胚CAM模型中，ADM2敲低显著降低原发肿瘤血管渗漏性。在静脉注射转移模型中，ADM2敲低细胞形成的转移灶数量和大小均显著减少，且侵袭性降低。ADM2敲低还直接损害了HT1080和MDA-231细胞的血管外渗及后续转移定植能力。

5. 靶向肾上腺髓质素2在体外抑制多种癌细胞系的血管内渗

研究人员利用体外微流控血管内渗平台验证了ADM2在多种癌细胞系中的作用。表达scramble shRNA的HT1080细胞快速侵入2D通道并成功发生血管内渗，而ADM2缺失细胞侵袭显著较慢，并在低（0.3 dyne/cm2）和高（3 dyne/cm2）剪切应力下逆转侵袭方向，滞留在微通道内。与体内结果一致，成功血管内渗的细胞大部分为ATF2^high细胞。人乳腺癌（MDA-231）、骨肉瘤（KHOS）和胶质母细胞瘤（U87）细胞也观察到类似结果。生物信息学分析显示，ADM2在多种人类癌症中过表达，包括乳腺浸润癌、结肠腺癌、肺腺癌和前列腺腺癌，且ADM2过表达与肾上腺皮质癌、脑低级别胶质瘤和间皮瘤患者的较差预后呈负相关。

五、讨论与结论

研究揭示了人ADM2肽类激素在驱动癌细胞转移中的关键作用，转移级联的多个步骤均由肿瘤细胞中ADM2表达所促进。ADM2过表达的ATF2^high癌细胞代表原发肿瘤中具有转移特征的独特亚群，定位于血管周围区域并沿血管壁快速侵袭。ADM2表达对形成大的、具备血管内渗能力的肿瘤血管是必需的，敲低ADM2可显著减小肿瘤血管直径并抑制癌细胞血管内渗。ADM2还驱动转移灶的侵袭性扩张，ADM2缺陷细胞形成的转移灶小且无侵袭性。这些发现确立了ADM2作为“一体化”治疗靶点的地位，可同时抑制癌细胞的瘤内血管侵袭、血管内渗和侵袭性转移灶形成能力。ADM2基因具有高度可靶向性，小分子抑制剂、拮抗肽、抗体和脂质纳米颗粒等多种策略已存在或正在开发中。研究还提出若干待解答的科学问题，包括ADM2过表达细胞的血管周围定位是否为大血管形成所必需、癌细胞分泌的ADM2是否直接作用于内皮细胞上的CRLR/RAMP受体以促进局部血管内皮重排、以及ADM2是否通过抑制经典Wnt信号通路促进癌细胞血管内渗和转移。综上所述，研究结果将ADM2确立为独特的治疗靶点，有望在多种人类癌症中同时破坏转移的多个阶段。