《Physiology & Behavior》：Time-of-Day Effects of Platelet-Derived Exosomes on Cognitive-Emotional Functions in an Animal Model of Methamphetamine Addiction
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•血小板外泌体在甲基苯丙胺成瘾动物模型中促进神经发生。•外泌体治疗的疗效受昼夜节律调控。•在休息期给药可更显著地诱导神经发生。引言药物成瘾是一种慢性的、复发的且复杂的疾病，对个人和公共卫生构成广泛威胁。甲基苯丙胺（METH）是最常滥用的成瘾性物质之一，近几十年来在许多国家的使
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血小板外泌体在甲基苯丙胺成瘾动物模型中促进神经发生。
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外泌体治疗的疗效受昼夜节律调控。
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在休息期给药可更显著地诱导神经发生。
引言
药物成瘾是一种慢性的、复发的且复杂的疾病，对个人和公共卫生构成广泛威胁。甲基苯丙胺（METH）是最常滥用的成瘾性物质之一，近几十年来在许多国家的使用率显著上升。根据世界毒品报告，2021年有3950万人被归类为临床药物使用障碍患者[1]。反复接触甲基苯丙胺与氧化应激增加、神经炎症和谷氨酸能毒性相关。细胞外多巴胺过度积聚导致自由基生成，进而损伤神经元膜。此外，NMDA型谷氨酸受体的过度激活可诱导海马、前额叶皮层和纹状体等关键脑区的神经元凋亡。这些损伤会导致记忆、决策能力以及多种神经和认知功能障碍的损害[[2], [3], [4], [5]]。
尽管药物和 psychotherapy 治疗取得了进展，但药物脑渗透性有限、高复发率和治疗抵抗性等问题凸显了探索影响疗效因素的必要性。一个基本但常被忽视的因素是治疗给药时机及其与昼夜节律的协调。昼夜节律是几乎所有生物体中以约24小时为周期发生的一种生物波动。这些节律由脑中的中枢时钟（视交叉上核）调控，并影响广泛的生理、行为和心理过程[6]。有趣的是，最新研究表明血脑屏障（BBB）本身也表现出昼夜节律。这种内源性生物钟显著影响BBB功能，从而影响脑内分子转运和生理反应的动态变化。证据表明，中枢时钟基因调控BBB内皮细胞的通透性和细胞黏附蛋白的表达[7]。例如，核心时钟基因BMAL1在BBB的最优功能中起着至关重要的作用[8]。实验研究表明，BBB处转运蛋白（如P-糖蛋白）的表达受昼夜节律影响，并可能在一天中的特定时间显著改变精神类药物的吸收或外排[9]。这一主题对于优化治疗，特别是在神经系统疾病领域，具有重要意义。动物和人类研究已提供证据支持基于昼夜节律的某些中枢神经系统活性药物的时间治疗策略，依据是药物在脑中的输送存在昼夜节律以及给药时间不同导致药物疗效和毒性差异[[10], [11], [12], [13]]。
另一方面，研究表明细胞外囊泡（EV），尤其是外泌体，为物质跨血脑屏障转运提供了新的途径。细胞间的转移是EV的重要特征，在研究和临床治疗应用中引起了研究人员的关注[14,15]。既往研究表明，EV的细胞间通讯参与突触可塑性和髓鞘维持等生理过程，同时也介导神经保护并调节再生过程。在这方面，外泌体作为信息传递和细胞间信号的生物介质，其作用非常重要。外泌体能够携带物质、使其在血循环中保持稳定、进入靶细胞并释放治疗性药物。这些特性使它们成为极具吸引力的天然载体。此外，外泌体能够穿越BBB，建立中枢系统与外周系统之间的通讯[16]。它们还能逃避机体的免疫反应，且由于其结构中存在脂质囊泡，可抵抗酶和核糖核酸酶的降解[17]。多项研究指出，外泌体在脑肿瘤以及阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经系统疾病的药物输送中具有潜在应用价值[18,19]。其中，血小板来源的外泌体（pExo）是一个更为理想的治疗选择，因为它们不受细胞培养的限制，且可通过抽血方式以最小的侵入性轻松获取[20]。研究表明，在神经退行性疾病的动物模型中，血小板衍生物可通过减少神经炎症、防止神经元凋亡和促进神经发生发挥显著的神经保护作用[[21], [22], [23], [24]]。例如，在阿尔茨海默病模型中，血小板衍生物促进了原代神经元的增殖和存活，增强了海马神经发生，减少了β-淀粉样蛋白诱导的神经退行性变，并支持了长时程增强作用[25]。此外，在帕金森病模型中，血小板衍生物显著保护神经元免受MPP毒性损害，减少炎症并改善运动功能。这些衍生物通过激活Akt和MEK通路提供强效的神经保护作用[26,27]。在最近的一项研究中，本研究团队探讨了pExo对抗甲基苯丙胺诱导神经毒性的神经保护作用。研究结果显示，pExo治疗显著改善了甲基苯丙胺处理大鼠的学习、空间记忆和识别能力，同时减少了抑郁和焦虑样行为。这些行为改善伴随着凋亡和神经元丢失的减少以及海马细胞增殖的增强。此外，pExo给药还减轻了炎症因子和氧化应激标志物（Mohtashami，2025）。
鉴于外泌体在神经退行性疾病和甲基苯丙胺诱导的神经毒性中已显示的治疗潜力，以及越来越多的证据表明其潜在机制（包括BBB完整性的调控）受昼夜节律影响，在昼夜节律框架内探索其功能可能产生重要的见解。因此，本研究旨在探讨给药时间对pExo在甲基苯丙胺诱导神经毒性中的疗效的作用。研究基于BBB通透性的昼夜变化来探究pExo的给药时机，可能为增强成瘾治疗的疗效和管理开辟新的视野。
各章节摘要
动物和实验分组
60只雄性Wistar大鼠（200–250 g）购自伊朗德黑兰巴斯德研究所，在标准实验室条件下饲养（12小时光照/黑暗周期，温度21 ± 3 °C），自由摄食和饮水。所有实验操作均按照《实验动物饲养和使用指南》进行（批准编号：IR.SHMU.AEC.1402.014）。动物在实验前至少适应动物房环境一周。
大鼠
血小板来源外泌体的表征
使用Zetaview分析仪测定外泌体的粒径分布和数量（图2）。平均量化数量为8.13E+8个颗粒/ml。外泌体的电子显微镜观察显示其为圆形颗粒，粒径范围在59–179 nm之间，平均粒径为72.5 nm（图2A）。
休息期起始给药pExo在记忆和学习方面的改善显著优于活跃期起始给药
基于Morris水迷宫学习阶段的数据，时间的主效应显著（F(3, 162) = 65.75，p < 0.0001；图3A），表明在学习训练天过程中学习成功。
讨论
本研究旨在探讨给药时间在pExo对甲基苯丙胺诱导神经毒性中的作用。本研究表明，pExo给药显著改善了学习、记忆和焦虑相关行为。此外，pExo给药可减少甲基苯丙胺诱导神经毒性后大鼠脑DG区的细胞死亡、凋亡和神经炎症。
既往研究已证实血小板衍生物在模型中的神经保护作用
局限性与未来方向
应承认本研究存在若干局限性。首先，时间依赖性影响仅在两个离散的授时因子时点进行评估，即休息期起始（ZT0）和活跃期起始（ZT12）。尽管该设计使两个生物学相关阶段之间的直接比较成为可能，但可能忽略了其他时间区间涌现的效果。这一问题在甲基苯丙胺暴露的背景下尤为重要，
临床意义与转化潜力
本研究结果表明，pExo的治疗效果可能因给药时间不同而异，表明对甲基苯丙胺诱导神经毒性的保护存在时间依赖性差异。这些结果支持了每日24小时周期中的治疗时机可能是优化外泌体干预的重要变量的观点。尽管潜在机制尚待阐明，但观察到的昼夜/时间差异可能提供
结论
本研究提示，pExo的疗效取决于给药时间，对神经发生、记忆、凋亡、焦虑样行为和神经炎症具有有益影响。这些发现表明，昼夜/时间因素可能有助于神经保护反应的变异，并突出了在优化外泌体干预时考虑治疗时机的重要性。总体而言，本研究有助于
伦理声明
本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：伊朗实验动物饲养和使用指南。本研究已获沙胡罗德医科大学批准。（批准编号：IR.SHMU.AEC.1402.014）
资助
本研究由沙胡罗德医科大学资助（资助编号：200168）。
作者贡献声明
Tayebeh Mohtashami：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，调查研究，形式分析。Amir Atashi：撰写–审阅与编辑，监督，方法学，形式分析。Mehdi Khaksari：撰写–审阅与编辑，验证，监督，方法学，概念化。Behzad Garmabi：撰写–审阅与编辑，验证，监督，项目管理，方法学，经费获取，概念化。
致谢
感谢沙胡罗德医科大学研究副院长对本博士研究项目的财政支持。此外，感谢Shima Mohammadi博士和Fahimeh Mohseni博士的帮助。
Tayebeh Mohtashami|Amir Atashi|Mehdi Khaksari|Behzad Garmabi
