MdNAC72-like通过转录激活MdSOS2和MdSOS3增强苹果耐盐性

《Plant Physiology and Biochemistry》：MdNAC72-like enhances salt tolerance in apple through transcriptional activation of MdSOS2 and MdSOS3

　　

苹果（Malus × domestica）的耐盐性受复杂的转录调控网络控制。研究人员鉴定出MdNAC72-like为苹果耐盐性的正调控因子。MdNAC72-like通过直接结合并激活MdSOS₂和MdSOS₃的启动子，增强盐过度敏感（Salt Overly Sensitive, SOS）信号通路的转录输出，从而降低Na⁺积累并提高耐盐性。进一步研究发现，MdbHLH89与MdNAC72-like发生蛋白互作，并抑制MdNAC72-like对MdSOS₂和MdSOS₃的转录激活能力。MdNAC72-like–MdbHLH89模块精细调控SOS途径介导的盐适应。该工作揭示了苹果耐盐性中一个基于转录调控的新机制。

土壤盐分是限制植物生长和作物生产力的主要非生物胁迫因素，过量盐分引起渗透胁迫、离子毒性和活性氧（reactive oxygen species, ROS）损伤，破坏细胞内Na⁺与K⁺平衡。苹果作为重要温带果树，其生长发育和果实品质常受盐害制约。由于苹果童期长、自交不亲和、遗传背景复杂，传统耐盐育种耗时费力。转录因子通过识别下游启动子中的顺式元件来调节胁迫响应基因表达，其中NAC家族蛋白在苹果逆境适应中发挥重要作用。然而，苹果NAC转录因子是否直接调控维持Na⁺稳态的盐过度敏感（Salt Overly Sensitive, SOS）通路核心组分，此前尚不清楚。为此，研究人员以苹果砧木G935和‘Orin’愈伤组织为材料，开展转录组与分子生物学研究，以揭示NAC转录因子调控SOS通路的机制。

研究人员通过RNA-seq分析鉴定到盐诱导的NAC转录因子MdNAC72-like。在‘Orin’愈伤组织中过表达MdNAC72-like可显著增强愈伤组织在NaCl处理下的生长，降低Na⁺积累，并上调MdSOS₂和MdSOS₃的表达。分子实验证明，MdNAC72-like直接结合MdSOS₂和MdSOS₃启动子中的特定NAC结合基序，并激活其转录。进一步研究发现，bHLH家族成员MdbHLH89可与MdNAC72-like互作，并抑制后者对MdSOS₂和MdSOS₃的DNA结合及转录激活活性。该研究首次证明苹果NAC转录因子直接激活SOS通路核心组分，并揭示MdNAC72-like–MdbHLH89模块精细调节SOS基因表达的机制，为苹果耐盐种质和砧木的遗传改良提供了候选基因。

主要关键技术方法包括：对150 mM NaCl处理20天的G935砧木组培苗进行转录组测序（RNA-seq）和差异表达分析；通过农杆菌介导法在‘Orin’苹果愈伤组织中过表达MdNAC72-like，进行耐盐表型与Na⁺含量测定；采用酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶（LUC）报告系统检测MdNAC72-like对MdSOS₂和MdSOS₃启动子的结合与激活；采用酵母双杂交（Y2H）、Pull-down和荧光素酶互补成像（LCI）验证MdNAC72-like与MdbHLH89的互作；并通过EMSA和LUC验证MdbHLH89对MdNAC72-like的抑制作用。RNA-seq数据已提交国家基因组科学数据中心（GSA），编号为CRA082387。

研究结果如下。3.1 盐胁迫抑制苹果砧木组培苗生长并造成生理损伤：通过150 mM NaCl处理20天，发现植株高度增长量、总根长和总根表面积显著下降，电解质渗漏和丙二醛含量上升，脯氨酸含量升高，表明盐胁迫导致生长受抑、膜脂过氧化和渗透调节增强。3.2 转录组分析鉴定MdNAC72-like为盐诱导NAC转录因子：RNA-seq共鉴定到8912个差异表达基因，功能富集显示转录调控和多种代谢途径被激活；其中MdNAC72-like（LOC103407991）在盐处理下显著上调，且时间进程分析显示其表达在6小时开始升高、1天达到峰值，之后仍高于对照水平。3.3 过表达MdNAC72-like增强苹果愈伤组织耐盐性：过表达株系在100和200 mM NaCl条件下生长优于野生型，鲜重增加，Na⁺含量低于野生型；盐响应基因表达分析显示MdSOS₂和MdSOS₃显著上调，而MdSOS₁、MdNHX₁和MdNHX₂无显著变化，表明MdNAC72-like特异正调控SOS途径基因。3.4 MdNAC72-like直接结合并激活MdSOS₂和MdSOS₃启动子：亚细胞定位和酵母实验表明MdNAC72-like定位于细胞核且具有转录激活活性；Y1H和EMSA证明其可直接结合MdSOS₂启动子中的N1、N5基序以及MdSOS₃启动子中的N9基序；LUC报告实验显示MdNAC72-like显著增强两个启动子的活性。3.5 MdbHLH89与MdNAC72-like在体内外互作：Y2H、Pull-down和LCI证明二者存在物理互作；MdbHLH89在盐处理下转录水平无明显变化，提示其受盐胁迫的转录调控较弱。3.6 MdbHLH89削弱MdNAC72-like介导的MdSOS₂和MdSOS₃激活：EMSA中加入MdbHLH89可剂量依赖性地抑制MdNAC72-like与靶序列结合；LUC分析显示MdbHLH89共表达显著抑制MdNAC72-like对MdSOS₂和MdSOS₃启动子的转录激活，证明MdbHLH89是MdNAC72-like的负调控因子。

讨论指出，MdNAC72-like是首个被发现直接激活SOS核心组件的苹果NAC转录因子。它协同上调MdSOS₂和MdSOS₃，可能增强SOS3–SOS2复合物形成与下游信号传递，从而有利于减少Na⁺积累，但该过程对MdSOS₁磷酸化活性的影响仍需进一步验证。MdbHLH89通过与MdNAC72-like互作抑制其DNA结合功能，可能防止防御反应过度激活而浪费能量，为应激响应与生长维持提供平衡。结论为：盐胁迫诱导MdNAC72-like表达，后者直接激活MdSOS₂和MdSOS₃的转录，从而增强SOS信号通路的能力；MdbHLH89与MdNAC72-like互作并削弱其启动子结合和转录激活活性，形成MdNAC72-like–MdbHLH89调控模块。该工作扩展了NAC转录因子在木本植物中的已知功能，为苹果耐盐种质和砧木改良提供了候选调控基因。