鸡LGALSL2（galectin-like protein 2）作为非哺乳动物galectin家族新成员：睾丸和附睾富含糖基囊泡结合与非经典糖结合特征

《Poultry Science》：Galectin-like protein 2: a new non-mammalian member of the galectin family

　　

galectin（半乳糖凝集素）家族由进化上保守的可溶性动物凝集素（animal lectins）组成。近期，该家族的一个新成员被描述：galectin-like 2（LGALSL2）。该蛋白含有一个球状结构域，其结构组织与galectin碳水化合物识别结构域（carbohydrate recognition domain, CRD）相同，但缺少结合β-半乳糖苷（β-galactosides）所需的一些氨基酸。尽管LGALSL2广泛存在于有颌脊椎动物（jawed vertebrates），但哺乳动物中不存在该蛋白。其氨基酸序列从软骨鱼到鸟类高度保守。这种保守性的焦点位于蛋白的凸面，该面与推测的聚糖结合沟槽（glycan-binding groove）相对。在鸡中，LGALSL2主要表达于睾丸和附睾。研究人员证明，重组鸡LGALSL2蛋白结合Sertoli细胞（Sertoli cell）细胞质中的囊泡结构以及附睾近端输出小管（ductuli efferentes proximales, Dep）囊泡。这些囊泡的位置提示其可能在生精液（seminiferous fluid）形成和重吸收中发挥作用。这些囊泡结构均富含碳水化合物。然而，广谱糖基微阵列（glycan microarray）筛选显示，在测试条件下，LGALSL2未显示与聚糖序列的显著结合，仅对少数岩藻糖基化聚糖（fucosylated glycans）观察到极弱信号。结果提示，LGALSL2不具有经典galectin功能。相反，其可能识别筛选阵列中未包含的“exotic”聚糖，或其活性可能较少依赖聚糖-蛋白相互作用，而更多依赖蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions）。由于LGALSL2的这些结合伙伴似乎参与生精小管液（seminiferous tubular fluid）的形成和周转，因此提示这种新的galectin样蛋白可能参与鸡精子成熟。

论文解读：鸡galectin-like protein 2（LGALSL2）在雄性生殖道中的表达、结合特征与功能提示

研究背景与问题：galectin（半乳糖凝集素）家族是进化上保守的可溶性动物凝集素，在双侧对称动物中具有广泛功能。有颌脊椎动物中经典galectin通过保守的碳水化合物识别结构域（carbohydrate recognition domain, CRD）结合β-半乳糖苷（β-galactosides）。CRD糖结合沟由A–E五个亚位点组成，其中C和D高度保守，A、B和E更可变并决定单个galectin的糖特异性。除经典galectin外，还有galectin-like proteins（LGALSL）和Grifin，它们可依据基因和蛋白结构及共线性研究归入galectin家族，但关键氨基酸发生改变，导致丧失结合β-半乳糖苷的能力。近期，LGALSL2被归类为galectin家族成员，存在于从软骨鱼到陆生脊椎动物的所有有颌脊椎动物类群，但在哺乳动物进化过程中丢失。问题是LGALSL2缺乏经典β-半乳糖苷结合所需的部分关键氨基酸，功能未知，且尚无针对LGALSL2的研究。鸡作为重要农业鸟类和发育生物学、系统发生学研究模式生物，其精子在睾丸中已达到较高成熟度，这与哺乳动物不同；睾丸和附睾中液体的形成和重吸收对精子成熟重要。因此，研究人员聚焦鸡LGALSL2在睾丸和附睾中的表达与结合特征。

研究开展与结论及意义：研究人员整合了系统发生与蛋白结构分析、定量表达分析、重组蛋白组织化学、凝集素组织化学和糖基微阵列筛选，发现鸡LGALSL2具有典型galectin折叠，但S-face沟发生变化，导致非经典糖结合特性。鸡LGALSL2表达于雄性生殖道，睾丸表达显著高于附睾。重组鸡LGALSL2结合睾丸Sertoli细胞和近端输出小管上皮中富含糖的囊泡。广谱糖基微阵列未检出显著糖结合，提示LGALSL2可能识别阵列未覆盖的“exotic”聚糖，或更多依赖蛋白质-蛋白质相互作用。该研究将LGALSL2与鸡生精液形成、重吸收及精子成熟联系起来，提示这一非哺乳动物galectin样蛋白具有区别于经典galectin的功能。

关键技术方法：研究人员通过共线性基因在NCBI Gene和Genome数据库中鉴定各gnathostome类群LGALSL2，用MEGA X进行序列比对和系统发生分析，用Robetta预测鸡LGALSL2结构，用Chimera X 1.8可视化，用AL2CO和独立计数权重确定保守序列。qRT-PCR使用11周龄公鸡睾丸和附睾（n=3），样本来自当地屠宰场（EU approval ES1635），按正常食品生产屠宰，无动物实验特殊伦理批准需求；数据以参考基因RPL37A等归一化。重组鸡LGALSL2在大肠杆菌AVB101中表达并进行体内生物素化，经亲和纯化。组织化学使用1岁公鸡睾丸和附睾石蜡切片，进行PAS（periodic acid-Schiff，高碘酸-希夫染色）、Masson-Goldner三色染色、重组生物素化LGALSL2结合及PNA（peanut agglutinin，花生凝集素）、AAL（Aleuria aurantia lectin）、SNA（Sambucus nigra agglutinin）和MAL-II（Maackia amurensis lectin II）凝集素染色。糖结合筛选采用NGL（neoglycolipid，新糖脂）基、序列明确的672种聚糖微阵列，并按MIRAGE指南进行。

研究结果：

1. Structural Properties of Galectin-Like Protein 2（LGALSL2的结构特性）：结构建模显示，LGALSL2具有典型galectin结构，由β-sheets形成两个表面。S1-S2 sheets及其间环在S-face形成凹槽，该沟槽在经典galectin中提供碳水化合物结合区域；相对的F1–F5 sheets形成凸出的F-face，在galectin中通常与蛋白结合伙伴相互作用。LGALSL2的S3-S4大片层间环显著大于其他对应CRD2的galectin结构域，例外是galectin-like protein LGALSL，也称HSPC159；在所有galectin中，LGALSL与LGALSL2氨基酸序列相似性最高。S3-S4环在有颌脊椎动物LGALSL2蛋白中也高度可变。比较保守性发现，F-face保守性最高，S-face几乎不保守。鸡LGALSL2计算二级结构与人galectin 9的CRD2具有相同β-sheet结构，但LGALSL2的S4、S5和S6 β-sheets中，介导galectin结合乳糖或N-acetylglucosamine的一些关键氨基酸缺失，S4 β-sheet尤其明显；S5和S6中关键氨基酸大多存在，例如介导与半乳糖环CH–π相互作用的W残基在所有分析的LGALSL2蛋白中存在。结论是LGALSL2为CRD2样galectin，S-face结合功能发生改变，F-face高度保守提示其可能参与蛋白互作。

2. Galectin Expression in Chicken Testis and Epididymis（鸡睾丸和附睾中galectin表达）：研究人员检索NCBI数据库中鸡组织RNA-Seq外显子覆盖数据，发现LGALSL2在睾丸组织表达最高。qRT-PCR分析显示，所有编码鸡galectin和两个galectin-like蛋白的基因在睾丸和附睾中均表达，但LGALSL表达很低。多数galectin基因在附睾中的表达强于睾丸；LGALS2和LGALSL2是例外，这两个基因在睾丸中显著更高表达，讨论中指出其在睾丸中约高五倍。结论是LGALSL2表达于鸡雄性生殖道，并以睾丸表达为突出特征。

3. LGALSL2 Binding Sites in Testis and Epididymis（LGALSL2在睾丸和附睾中的结合位点）：研究人员将LGALSL2重组表达于大肠杆菌，利用N端Avi-tag实现体内生物素化，并纯化蛋白。组织切片孵育生物素标记LGALSL2后，用荧光标记链霉亲和素检测。结果显示，LGALSL2弱结合围绕生精小管的lamina propria纤维；更强结合见于睾丸Sertoli细胞囊泡和附睾近端输出小管（Dep）上皮。未观察到对rete testis（Rt）或远端管道[ductuli conjugentes（Dc）和ductus epididymidis（De）]上皮的结合。PAS染色显示，Sertoli细胞质中有大量PAS阳性囊泡，Dep上皮顶端边界及其细胞质囊泡有强PAS染色；Rt和Dc/De上皮无富含碳水化合物结构；睾丸capsule、lamina propria和间质胶原纤维也呈强PAS染色。凝集素染色显示，Sertoli细胞中特征性PAS和LGALSL2阳性囊泡可被AAL和SNA识别，但不被PNA和MAL-II识别；Dep中PNA、AAL和SNA均染色囊泡，AAL和SNA尤其强；MAL-II染色Dep上皮顶端胞外结构。结论是LGALSL2结合Sertoli细胞和Dep上皮中富含糖的囊泡，这些囊泡位置提示其参与生精液形成和重吸收。

4. Microarray Analysis of the Glycan-Binding Properties of LGALSL2（LGALSL2糖结合特性的微阵列分析）：由于LGALSL2结合睾丸和附睾中富含碳水化合物的囊泡，研究人员用纯化生物素标记LGALSL2在包含672种聚糖的微阵列中筛选其潜在糖配体。结果显示，在所选条件下未检测到显著结合，仅对少数岩藻糖基化聚糖探针如Globo-H-Hexa和Leb-hexaosylceramide观察到非常弱的信号，且接近背景水平。作为对照，生物素化植物凝集素AAL在相同阵列中与几乎所有岩藻糖基化聚糖探针呈强结合。结论是LGALSL2不具备经典galectin糖结合功能，其可能识别筛选阵列未包含的“exotic”聚糖，或依赖蛋白质-蛋白质相互作用。

讨论部分总结：讨论指出，基于共线性、基因外显子-内含子结构和蛋白二级结构，LGALSL2可明确归为galectin家族，更具体地属于galectin的CRD2。其计算二级结构类似galectin，由两个反平行β-sheets组成。LGALSL2的S-face形成凹槽，在经典galectin中为聚糖结合位点，但一些介导galectin典型β-半乳糖苷结合所需的氨基酸缺失；其他保守氨基酸仍存在，例如S5 β-sheet中的W残基高度保守，并可通过CH–π相互作用参与经典galectin的糖-蛋白结合。与S-face相对，LGALSL2的F-face向外弯曲，通常作为galectin蛋白结合伙伴区域，在原型galectin中与同源或异源二聚化相关。种间比较显示S-face氨基酸保守性很低，而F-face显著更保守，提示LGALSL2可能的S-face配体，可能为聚糖，具有较高物种特异性；而结合F-face、可能参与galectin典型交联或信号转导的蛋白互作伙伴，在有颌脊椎动物中可能相对保守。LGALSL2与LGALSL氨基酸序列最相似；LGALSL的S-face在gnathostome物种间也少保守，F-face高度保守，这使两种galectin-like蛋白区别于经典galectin。LGALSL在哺乳动物中表达，但自单孔目开始，galectin S5 β-sheet中高度保守的W被精氨酸替代，导致CH–π相互作用不再可能，提示哺乳动物进化中LGALSL发生功能改变，并伴随LGALSL2基因丢失。表达数据提示LGALSL2仅在少数组织显著表达，睾丸是其中之一；qRT-PCR显示其在睾丸和附睾均表达，且多数galectin在附睾表达更强，但LGALSL2和LGALS2在睾丸更高。讨论还指出，LGALS2在哺乳动物雄性生殖道未见报道，其哺乳动物功能主要与胃肠道上皮完整性和黏液层强度有关；公共转录组数据提示LGALS2在某些非哺乳动物脊椎动物睾丸中表达较高。单细胞转录组研究提示，LGALSL2在圆形和伸长精子细胞及成熟精子中上调，Log₂ fold changes分别为1.4、1.7和0.8，而其他鸡galectin未在这些细胞中上调；尚无附睾对应单细胞研究。组织学提示，Sertoli细胞囊泡可能代表吞噬残余体形成的吞噬体，或负责分泌与精子生育相关蛋白并形成生精小管液的囊泡。鸡精子在生精小管中达到较高成熟度，离开睾丸时已具有大部分活力并部分具备受精能力，随后在附睾中增强，这与哺乳动物不同。Dep上皮非纤毛细胞具有丰富内吞/溶酶体装置，负责重吸收生精小管液；LGALSL2结合的Dep细胞具有基底核，符合非纤毛重吸收细胞特征。LGALSL2强结合Sertoli细胞囊泡和Dep非纤毛细胞内体/溶酶体，提示其结合由Sertoli细胞产生、随后被Dep上皮重吸收的化合物，但当前研究未确定具体结合伙伴，需要进一步研究。与鸭、人、小鼠和猫等凝集素结合模式比较显示，附睾糖基组成存在明显物种差异，鸟类附睾在聚糖序列层面了解不足；鸟类输出小管高度折叠并主导附睾，附睾管较小，这与哺乳动物复杂附睾不同。微阵列筛选未检出相关糖配体，研究人员认为若LGALSL2具有糖结合活性，其配体可能是未包含在该探针集中的“exotic”聚糖，如表达于mucin骨架上的聚糖；此外，组织学中观察到的结合信号也可能来自蛋白质-蛋白质相互作用，而这是galectin家族成员已知特征。

研究结论翻译：LGALSL2蛋白是有颌脊椎动物谱系中galectin家族高度保守成员。它们与原型galectin高度同源，但S-face沟的变化导致β-半乳糖苷结合功能丧失。鸡LGALSL2表达于雄性生殖道，睾丸表达水平显著高于附睾。重组鸡LGALSL2结合睾丸Sertoli细胞和近端输出小管（D. efferentes proximales）上皮细胞中富含聚糖的囊泡。这提示该蛋白可能在鸡生精液中发挥作用，该液体由Sertoli细胞分泌并由输出管上皮重吸收，对精子成熟重要。然而，用于鉴定鸡LGALSL2可能糖结合伙伴的微阵列筛选在使用条件和微阵列集合下未检测到相关配体。因此，研究人员可以认为LGALSL2具有较“exotic”的聚糖配体，或在睾丸/附睾组织中通过蛋白质-蛋白质相互作用发挥功能。