《Poultry Science》：Regulatory function and effective variation identification of egg-laying related candidate gene ANK2 in chickens
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尽管已发现了大量与产蛋相关的候选基因和位点，但大多数研究仅建立表型相关性，缺乏功能验证和变异鉴定，限制了分子育种的推广应用。本研究系统探究了鸡产蛋相关候选基因锚蛋白2（Ankyrin 2, ANK2）的调控功能及有效功能变异。首先，通过基于ANK2基因组区域的
尽管已发现了大量与产蛋相关的候选基因和位点，但大多数研究仅建立表型相关性，缺乏功能验证和变异鉴定，限制了分子育种的推广应用。本研究系统探究了鸡产蛋相关候选基因锚蛋白2（Ankyrin 2, ANK2）的调控功能及有效功能变异。首先，通过基于ANK2基因组区域的群体遗传学分析和多种类型全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS），研究人员确认ANK2在鸡驯化和产蛋定向育种过程中经历了强烈的人工选择，且该基因的多个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）与产蛋数和就巢性状显著相关，证明了ANK2作为鸡产蛋性状关键候选基因的遗传基础。下丘脑-垂体-卵巢轴（hypothalamic-pituitary-ovarian axis, HPO）中的表达特征分析显示，ANK2仅在高产和低产母鸡的卵巢中差异表达，其卵巢表达水平与产蛋性状正相关，并在卵泡发育过程中动态表达。进一步，敲低ANK2改变了鸡卵巢颗粒细胞的转录组，抑制了类固醇合成相关基因和孕酮分泌，并抑制了颗粒细胞的增殖和分化。最后，研究人员从两个地方鸡品种中筛选出ANK2的3个候选有效变异，并验证其中一个SNP chr4:56869062C>T通过调控ANK2表达，有助于解释鸡群体间产蛋表型差异，且其C等位基因在高产品种中富集。该研究为鸡产蛋性能分子育种提供了功能基因和分子标记资源。
产蛋性状（如产蛋数、开产日龄和就巢大小）是决定蛋鸡养殖经济效益和禽种业核心竞争力的重要经济性状，也是蛋鸡遗传改良和分子育种的首要目标性状。这类性状属于复杂数量性状，由下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO）在多基因和信号通路协调下共同调控，且遗传力中等偏低，传统表型选择育种周期长，制约了遗传进展。随着全基因组关联分析（GWAS）、转录组测序和表达数量性状位点（eQTL）作图等组学技术的应用，挖掘关键候选基因和筛选功能分子标记已成为实施标记辅助选择（MAS）和产蛋定向育种的关键策略。然而，现有研究大多仅发现与产蛋性状显著关联的候选位点或基因，缺乏候选基因体内/体外功能的系统验证和有效变异的精确鉴定，导致分子标记难以在实际育种中转化应用。锚蛋白2（ANK2）编码细胞骨架蛋白ankyrin B，在哺乳动物中广泛表达，其遗传变异与长QT综合征、癫痫和自闭症等疾病相关。研究团队前期基于不同产蛋性能鸡品种的全基因组选择信号分析提示ANK2在蛋鸡驯化和产蛋育种中受到强烈选择，但其在禽类中是否通过HPO轴组织调控产蛋表型、以及哪些有效变异能改变ANK2表达进而影响产蛋性状，仍不清楚。为此，研究人员开展了本研究，旨在系统阐明ANK2调控鸡产蛋性状的分子机制，并挖掘可用于育种的分子标记。
研究人员以固始鸡（GS）、广西瑶鸡（GY）和海兰褐（HL）蛋鸡为研究对象，并整合了900只GS鸡、90只多品种鸡和300只GY鸡的全基因组重测序数据以及已有的HPO轴多组织转录组数据。主要技术方法包括：基于ANK2基因组区域SNP的主成分分析（PCA）和多形式GWAS；HPO轴组织表达特征分析及表达与产蛋性状的相关分析；鸡原代卵巢颗粒细胞分离培养与siRNA介导的基因敲低；敲低组和对照组的RNA-seq转录组测序及差异表达基因GO富集分析；qRT-PCR、ELISA、CCK-8和Western blot进行功能验证；JASPAR在线预测转录因子结合基序；双荧光素酶报告基因实验测定SNP等位基因的转录活性。统计采用SPSS等软件完成，显著性阈值设为p<0.05或p<0.01。
研究结果主要包括四个方面：
1. ANK2基因的遗传变异响应产蛋定向选择并与产蛋性状相关。基于8个鸡品种（商业蛋鸡、地方鸡和红原鸡）重测序数据提取ANK2区域5146个SNP进行PCA，结果显示商业蛋鸡群体与本地鸡、红原鸡群体显著分离，本地鸡与红原鸡也有一定分离，提示ANK2遗传变异在驯化和产蛋定向育种中受到强烈人工选择。进一步结合前期三种GWAS结果，共发现177个SNP与固始鸡就巢大小（如ACS26-30w、ACS39-43w、MCS）和产蛋数（如EN21-25w、EN31-43w）等性状显著相关，从基因组层面证实ANK2是产蛋调控的关键候选基因。
2. 卵巢中ANK2表达水平与鸡产蛋数和最大就巢大小正相关。利用43周龄高低产固始鸡HPO轴转录组数据，发现ANK2仅在下丘脑-垂体-卵巢轴中的卵巢组织差异表达，且高产组显著高于低产组。在不同产蛋阶段（28、36、50周龄）以及海兰褐与固始鸡品种间比较中，ANK2的差异表达也仅在卵巢中出现。在广西瑶鸡群体中，ANK2卵巢表达量与41周龄产蛋数（EN41w）和最大就巢大小（MCS）均呈显著正相关。卵泡表达动态分析显示，ANK2在前等级卵泡发育阶段随卵泡增大而升高，在小黄卵泡（SYF）中表达急剧上升，大黄卵泡（LYF）维持较高水平，进入排卵前卵泡（F6至F1）后逐渐下降，提示ANK2可能参与鸡卵巢卵泡生长和选择。
3. 敲低ANK2抑制鸡卵巢颗粒细胞孕酮产生和细胞增殖。在鸡原代卵巢颗粒细胞中转入si-ANK2使ANK2表达降低73%。转录组测序共鉴定出65个差异表达基因（10个上调、55个下调），富集于糖皮质激素合成、血管通透性负调控、结缔组织发育和蛋白质去泛素化等生物过程。功能验证显示，ANK2敲低显著下调类固醇合成关键基因STAR、CYP11A1和3β-HSD的mRNA水平，并降低细胞上清中孕酮（PROG）含量；同时抑制增殖标志基因CDK1、CCND1和分化标志基因FSHR、BMP15的表达，并减少活细胞数量。这些结果表明ANK2能促进鸡卵巢颗粒细胞的增殖、分化以及孕酮合成。
4. 探索调控ANK2表达的候选有效变异。在固始鸡和广西瑶鸡群体中分别进行ANK2区域SNP与产蛋性状的关联分析，取交集获得5个共有显著SNP。通过JASPAR预测转录因子结合基序，发现其中3个SNP（chr4:56733027T>G、chr4:56869062C>T、chr4:56869194T>C）位于高评分转录因子结合基序内，被列为候选有效变异。进一步以chr4:56869062C>T为重点，基因型-表达关联分析显示TC基因型个体卵巢中ANK2表达量显著高于TT基因型；双荧光素酶报告实验证明C等位基因的转录活性显著强于T等位基因；等位基因频率分析显示，C等位基因在相对高产的贵妃鸡中频率明显高于低产的广西瑶鸡和固始鸡。该SNP可通过调控ANK2表达影响平均就巢大小（ACS26-30w），可作为产蛋性能分子育种的潜在标记。
在讨论部分，作者指出，长期定向选择会使产蛋相关变异在群体中累积并逐步固定有利等位基因，ANK2区域在商业蛋鸡、地方鸡和红原鸡间的群体分化与选择信号分析结果一致。ANK2在HPO轴中的表达特征和功能实验共同表明，该基因主要通过卵巢而非下丘脑-垂体组织发挥调控作用，其机制涉及促进颗粒细胞增殖、分化和类固醇合成。有效变异鉴定策略将前期GWAS关联结果与两个地方鸡群体的交集分析相结合，筛选出位于转录因子结合基序内的候选功能SNP，并借助双荧光素酶实验证实chr4:56869062C>T的C等位基因可通过招募Mycn等转录因子增强转录活性，从而有利于产蛋性状。研究结论可翻译为：综上所述，本研究系统探究了鸡ANK2基因的遗传特征、表达模式、生物学功能和有效功能变异，证实ANK2通过促进卵巢颗粒细胞增殖和孕酮产生正调控鸡产蛋性能；筛选出3个位于非编码区的候选有效变异，并验证SNP chr4:56869062C>T通过调控ANK2表达有助于解释鸡群体间ACS26-30w的差异，为鸡产蛋性能的分子标记辅助育种和基因组编辑育种提供了功能基因和分子标记资源。同时，研究也指出局限性：ANK2功能尚需体内敲除或过表达实验验证；关键SNP的表型关联需更大样本和更多品种进一步确认；ANK2调控颗粒细胞增殖和激素合成的具体分子机制仍需深入探究。
