《Redox Biology》：Disruption of p62 ubiquitination by α-methylene-γ-butyrolactone enhances Keap1 lysosomal degradation for ulcerative colitis therapy
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溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以复发性肠道炎症、黏膜屏障功能障碍和免疫失调为特征的慢性炎症性肠病。尽管现有疗法如氨基水杨酸类药物和生物制剂具有一定疗效，约35%的患者仍因原发无应答、疗效丧失或安全性问题而治疗失败，亟需发现新的
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种以复发性肠道炎症、黏膜屏障功能障碍和免疫失调为特征的慢性炎症性肠病。尽管现有疗法如氨基水杨酸类药物和生物制剂具有一定疗效，约35%的患者仍因原发无应答、疗效丧失或安全性问题而治疗失败，亟需发现新的治疗靶点和小分子药物。UC涉及免疫-氧化性结肠炎症及黏膜微环境（colonic mucosal microenvironment，CMM）破坏，巨噬细胞M1/M2极化失衡在其中发挥关键作用。p62作为选择性自噬关键适配蛋白，可结合Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）并促进其降解，进而激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗氧化通路。研究人员前期基于倍半萜内酯（sesquiterpene lactones，SLs）的保守结构骨架设计合成了α-亚甲基-γ-丁内酯（α-methylene-γ-butyrolactone，αMγB），该化合物具有良好安全性和抗炎活性。本研究旨在阐明αMγB抑制UC中M1巨噬细胞极化的分子机制。研究结果表明，p62敲低可加重小鼠急性肺炎和葡聚糖硫酸钠盐（dextran sulfate sodium salt，DSS）诱导的UC。αMγB通过共价靶向p62蛋白第291位半胱氨酸（C291），烷基化修饰后空间阻碍邻近第297位赖氨酸（Lys297）的泛素化，减少p62的泛素-蛋白酶体途径降解，从而稳定p62蛋白。稳定的p62增强与Keap1的结合并促进其经自噬溶酶体途径降解，释放并激活Nrf2，启动下游抗氧化基因的转录。p62-C291S突变或Nrf2抑制可完全消除αMγB在UC模型中的疗效。αMγB通过重编程巨噬细胞极化和恢复黏膜免疫稳态发挥治疗UC的作用，为开发αMγB衍生物治疗UC提供了机制基础。
一、研究背景与科学问题
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性炎症性肠病，以反复发作的肠道炎症、黏膜屏障功能障碍和免疫调节异常为核心病理特征。随着全球发病率持续上升，UC严重影响患者生活质量，并增加结直肠癌、原发性硬化性胆管炎等长期风险。尽管氨基水杨酸类药物和生物制剂在临床上取得一定疗效，约35%的患者因原发性无应答、疗效衰减或安全性问题而治疗失败，因此亟需开发新的治疗靶点和小分子药物。UC的发病涉及免疫-氧化性结肠炎症和黏膜微环境（colonic mucosal microenvironment，CMM）破坏，其中巨噬细胞M1/M2极化失衡是驱动炎症持续和组织损伤的关键事件。M1型巨噬细胞释放活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），破坏上皮紧密连接、抑制杯状细胞功能并招募中性粒细胞；而M2型巨噬细胞功能受损则阻碍组织修复。因此，促进M1向M2巨噬细胞再极化被认为是一种有前景的UC治疗策略。
p62（由基因Sqstm1编码）是选择性自噬中的关键适配蛋白，介导泛素化底物的降解，并在UC发病中发挥重要作用。p62通过其KIR结构域结合Keap1，竞争性干扰Keap1-Nrf2相互作用并促进Keap1降解，从而激活Nrf2及其下游抗氧化基因的转录。p62本身又受Nrf2转录调控，形成p62-Nrf2正反馈环路。靶向这一环路以调节巨噬细胞极化、打破氧化应激-炎症循环，是治疗UC的潜在策略。天然倍半萜内酯（sesquiterpene lactones，SLs）是多种传统抗炎草药的有效成分，但受限于纯化复杂、天然含量低等问题，其开发受到阻碍。研究人员前期基于SLs的保守结构基序设计合成了α-亚甲基-γ-丁内酯（α-methylene-γ-butyrolactone，αMγB），该化合物保留了进化保守的抗炎骨架，能有效促进巨噬细胞从促炎M1表型向抗炎M2表型再极化，并在体外和体内表现出优于阿司匹林、吲哚美辛和地塞米松的安全性和抗炎功效。该论文发表于《Redox Biology》，旨在阐明αMγB抑制UC中M1巨噬细胞极化的分子机制，为其衍生药物开发提供理论基础。
二、主要技术方法
研究人员综合运用多种关键技术方法开展研究。细胞实验方面，使用RAW264.7、THP-1、HEK293T、NCM460细胞系以及小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）和腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages，PEMs）。动物模型方面，建立LPS诱导的急性肺炎模型和DSS诱导的UC模型，并使用Sqstm1基因敲除小鼠、腺相关病毒（AAV9）介导的Sqstm1野生型或C291S突变体回补小鼠。临床样本方面，收集结直肠癌患者配对癌组织和癌旁组织（n=5）进行验证。关键分子机制研究技术包括：定量蛋白质组学（LC-MS/MS）鉴定αMγB的靶蛋白及共价结合位点；转录组测序分析差异表达基因及KEGG通路富集；细胞热转移分析（cellular thermal shift assay，CETSA）和药物亲和力响应靶标稳定性分析（drug affinity responsive target stability，DARTS）验证药物-靶蛋白直接结合；click chemistry结合pull-down实验证实αMγB-Linker探针直接捕获p62蛋白；共免疫沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）检测蛋白相互作用；免疫荧光、免疫组化、Western blotting、RT-qPCR等分析蛋白和mRNA表达；流式细胞术分析巨噬细胞极化和T细胞亚群；双荧光素酶报告基因检测Nrf2-ARE结合活性。
三、主要研究结果
3.1 p62敲低小鼠表现出加重的炎症表型
GEPIA2数据库分析显示结直肠癌（colorectal cancer，CRC）组织中SQSTM1 mRNA表达上调，并在临床CRC样本和结直肠癌细胞系中得到验证。研究人员据此假设p62可能参与UC向CRC进展的病理过程。然而，在p62敲低小鼠中，急性炎症模型血清、肝脏和肺组织中促炎介质（IL-6、TNF-α、MCP-1、IFN-γ、p65和iNOS）的蛋白和mRNA水平均较野生型小鼠显著升高，M1巨噬细胞极化明显加剧。在DSS诱导的UC模型中，p62敲低加剧了结肠缩短、体重下降、脾脏指数升高、疾病活动指数（DAI）增加和结肠结构完整性破坏，并导致促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-17、IL-23）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）水平升高，氧化损伤加剧，紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin 1、Claudin 1）表达下降，结肠巨噬细胞浸润和M1极化增强。这些数据确立了p62表达对UC及相关炎症状态的关键保护作用。
3.2 天然产物来源的p62/Nrf2激活剂αMγB减轻UC
无标记定量蛋白质组学分析发现αMγB显著上调巨噬细胞中p62蛋白表达，并在多种互补实验中验证。p62敲低可消除αMγB调节巨噬细胞极化的能力。转录组测序及KEGG富集分析显示αMγB处理BMDMs的差异表达基因显著富集于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）通路。在NCM460结肠上皮细胞中，αMγB上调p62表达并保护细胞免受TNF-α诱导的炎症损伤。巨噬细胞-结肠上皮细胞共培养实验表明，αMγB双向阻断致病性巨噬细胞和结肠上皮细胞之间的炎症串扰循环。在DSS诱导的UC小鼠模型中，αMγB显著缓解体重下降、血性腹泻、脾脏指数升高、结肠缩短和炎症浸润，恢复紧密连接蛋白表达，降低氧化损伤，下调促炎介质和M1极化标志物，同时升高M2标志物和IL-10水平。αMγB还改善DSS诱导的免疫缺陷，恢复脾脏和肠系膜中CD4+/CD8α+ T细胞比例，并重构肠道菌群。p62敲低可减弱αMγB对UC的保护作用。Nrf2抑制剂ML385显著消除αMγB的治疗效果，表明其功效依赖Nrf2信号通路。αMγB（10 mg/kg）的疗效与木香烃内酯（costunolide）和柳氮磺吡啶（sulfasalazine，SASP）相当，并且在14天给药后未观察到心、肝、脾、肺、肾的组织病理学异常。
3.3 αMγB通过p62介导的Keap1自噬-溶酶体降解激活Nrf2
RNA测序显示αMγB显著上调Nrf2调控的抗氧化基因（Hmox1、Nqo1、Gclm）。αMγB以时间和剂量依赖方式增加Nrf2及其下游靶标（HO-1、NQO1、GCL）的mRNA和蛋白水平，并促进Nrf2负调控因子Keap1的降解。αMγB促进Nrf2核转位及其与MAFG的异源二聚化，增强Nrf2-ARE结合活性。在自噬抑制剂氯喹（chloroquine，CQ）存在下，αMγB增强p62-Keap1相互作用和共定位，恢复LPS损伤的自噬通量，增强p62、Keap1与溶酶体标志物Lamp1的三重共定位，表明p62引导Keap1进入自噬溶酶体降解。p62沉默可消除αMγB介导的Keap1降解、Nrf2激活和下游靶标上调。Nrf2抑制后，αMγB不影响p62的mRNA水平但部分维持p62蛋白表达，证实αMγB触发p62-Nrf2正反馈环路。αMγB还促进p62磷酸化（特别是Ser349位点），增强其与Keap1的结合亲和力。
3.4 αMγB通过靶向p62并干扰其泛素化稳定p62蛋白
αMγB不影响p62的mRNA水平但上调p62蛋白表达，提示存在转录后调控机制。MG132（泛素-蛋白酶体抑制剂）和CQ联合实验表明αMγB不影响p62的溶酶体降解。放线菌酮（cycloheximide，CHX）脉冲追踪实验证实αMγB显著延缓p62降解，延长其半衰期。αMγB显著降低RAW264.7和NCM460细胞中p62的泛素化水平。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）筛选显示，αMγB不改变ZRANB1、USP15、USP20、Usp8等候选DUBs的mRNA水平，也不影响ZRANB1蛋白表达及其与p62的相互作用，排除了通过DUBs介导的调控机制。定量蛋白质组学二级质谱分析鉴定出αMγB共价结合p62的四个半胱氨酸残基（C219、C113、C26和C291）。CETSA和DARTS实验验证了直接结合。研究人员合成了αMγB-Linker探针，通过click chemistry亲和pull-down实验成功捕获p62蛋白，确认直接结合。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）竞争性结合αMγB后，αMγB失去调节巨噬细胞极化、干扰p62泛素化、促进Keap1降解和激活Nrf2信号通路的能力。
3.5 αMγB通过烷基化第291位半胱氨酸阻止第297位泛素化位点的暴露
PhosphoSitePlus?数据库分析显示Lys297位点对p62泛素化至关重要。分子对接模拟表明，αMγB结合C291后因其与Lys297的邻近性而空间阻碍Lys297的泛素化，破坏p62与E3泛素连接酶TRIM21的界面，阻止E3连接酶招募。Co-IP实验证实αMγB处理减少p62-TRIM21复合物形成。研究人员构建了p62-WT及四个半胱氨酸突变体（C26S、C113S、C219S、C291S），结果显示与其他位点突变不同，C291S突变显著削弱αMγB抑制NO产生、促炎细胞因子释放和M1极化标志物表达以及增强IL-10表达的能力。C291S突变部分消除αMγB介导的p62泛素化干扰、p62-Keap1结合增强、p62稳定化、Keap1自噬溶酶体降解和Nrf2信号通路激活。亲和pull-down实验进一步确认C291S突变降低αMγB与p62的结合。
3.6 αMγB在Sqstm1C291S突变小鼠中无法抑制巨噬细胞M1极化和缓解UC
通过结肠内注射AAV9-Sqstm1和AAV9-Sqstm1(C291S)至p62基因敲除小鼠并建立DSS诱导的UC模型，研究人员验证了p62-C291在体内的关键作用。Sqstm1野生型回补恢复αMγB缓解DSS诱导病理变化的能力，而C291S突变体回补不能恢复这些保护作用。ELISA结果进一步证实，Sqstm1野生型回补恢复αMγB抑制血清促炎介质（IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-17、IL-23、MPO）和增强IL-10表达的能力，而C291S突变体部分废除该功能。在肠道屏障保护方面，野生型回补恢复αMγB维持紧密连接蛋白表达的作用，C291S突变体无法恢复。在巨噬细胞极化调节方面，野生型回补完全恢复αMγB对BMDMs/PMs中M1/M2失衡的纠正作用，C291S突变体失去该能力。在信号通路激活方面，野生型回补恢复αMγB触发Keap1降解和Nrf2激活的能力，C291S突变体部分废除该作用。
四、讨论与结论
本研究表明，通过共价修饰p62-C291残基靶向增强p62稳定性，是打破UC中炎症和屏障破坏自我强化循环的有效治疗策略。与作为非特异性抗氧化剂不同，αMγB特异性干扰p62泛素化，触发自我放大的p62-Keap1-Nrf2正反馈环路，将巨噬细胞极化从M1重编程为M2，恢复结肠黏膜稳态。机制上，αMγB共价修饰p62-C291位点，空间阻碍相邻Lys297残基的泛素化，稳定p62并促进Keap1的溶酶体降解。Sqstm1C291S突变小鼠和Nrf2抑制模型中治疗效果的丧失证实C291修饰对αMγB保护活性不可或缺。共培养实验显示αMγB同时减弱巨噬细胞对上皮细胞的损伤和上皮细胞对巨噬细胞的反馈激活，从而打破自我强化的炎症环路。通过稳定p62、促进Keap1降解和激活Nrf2信号，αMγB抑制M1巨噬细胞极化和促炎细胞因子及ROS产生，恢复上皮紧密连接完整性，可能降低驱动结肠炎相关癌变的促肿瘤炎症和基因毒性微环境。αMγB对肠道菌群的重构效应可能主要源于其抗炎和屏障修复作用，黏膜愈合后有利于有益菌恢复，菌群代谢产物进而增强上皮修复和免疫稳态。
研究局限性包括：C291结合空间阻碍相邻Lys297泛素化的机制仍需位点定向突变直接验证；α,β-不饱和酮基团可能对其他蛋白组半胱氨酸残基具有潜在反应性，需进行蛋白组-wide选择性分析；急性DSS模型不能完全模拟人类UC的慢性、复发性和适应性免疫特征，未来应在慢性或复发模型及IL-10缺陷小鼠和T细胞转移结肠炎等免疫驱动模型中评估αMγB。
研究结论：本研究将p62泛素化的共价干扰鉴定为UC治疗的可成药机制。αMγB通过靶向p62-C291位点烷基化，干扰p62泛素化并稳定p62蛋白，促进Keap1自噬溶酶体降解和Nrf2释放激活，建立自我维持的p62-Nrf2抗氧化环路，重编程巨噬细胞极化并恢复结肠屏障完整性，最终缓解UC病理。这些发现支持αMγB作为UC治疗的候选化合物进一步评估，并值得研究其对结肠炎相关结直肠癌进展的潜在影响。
