提高肠道宏基因组二代测序可重复性的整合工作流程开发与评估

《Scientific Reports》：Evaluation and validation of a reproducible mNGS workflow for gut Microbiome analysis

　　

摘要

样本前处理和分析步骤中的技术变异显著阻碍了肠道宏基因组二代测序（mNGS）的可重复性。为此，我们开发并评估了一套实用的mNGS工作流程。通过评估三种商业保存缓冲液（A/B/C），我们发现PBB对原始微生物群落组成具有最高的保真度，而PBC在三缓冲液中表现出最强的鲁棒性，能够在37 °C下孵育九天内保持结构一致性。随后，我们引入了一种低成本、自制的抑制剂去除缓冲液（Self-IB）用于自动化提取，所得物种丰度与手动对照方法高度相关（R² > 0.998），表明其性能相当。优化后的工作流程表现出令人满意的批内和批间重复性，表现为操作者间高度相关性（R² > 0.99）以及各重复样本间稳定的香农多样性指数。根据应用需求——无论是优先考虑初始群落保真度还是在热应激下的长期稳定性——均可相应选择PBB或PBC。总之，本研究为肠道微生物组研究提供了一套涵盖样本保存至核酸提取的整合工作流程，有助于提高mNGS数据的可靠性和鲁棒性。