《Scientia Horticulturae》：Multi-omics dissection of volatile aroma biosynthesis and its potential regulation throughout guava fruit development
番石榴（Psidium guajava L.）是一种具有重要经济价值的热带和亚热带水果作物，因其独特的风味、高营养价值及广泛的消费者接受度而被广泛种植。果实香气是决定消费者偏好和市场价格的最关键因素之一，主要由包括酯类、醛类、醇类、萜类化合物和苯丙烷衍生物在内的复杂挥发性香气物质（volatile aroma compounds，VACs）混合物决定。这些化合物通过多条相互关联的代谢途径生物合成，主要包括负责C6和C9醛类及醇类合成的脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途径，以及包括胞质甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径和质体甲基赤藓醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径在内的萜类生物合成途径。此外，苯丙烷途径有助于产生与果香和花香特征密切相关的芳香族苯环类和酯类化合物。果实中VACs的组成和浓度高度动态变化，并受基因型、发育阶段、环境条件和采后处理等因素的强烈影响。以往对番石榴的研究揭示了不同品种间挥发性物质的显著差异，强调了遗传背景在决定香气特征中的主导作用。然而，现有研究主要集中于成熟果实或采后变化的静态比较，果实发育过程中香气生物合成的调控机制在很大程度上仍未得到探索。多组学技术的近期进展，特别是代谢组学与转录组学的整合，为研究复杂代谢性状的分子基础提供了有力工具。此类方法已成功应用于梨、番茄、猕猴桃和柑橘等多种水果，以阐明挥发性生物合成背后的动态调控网络。这些研究表明，果实香气形成不仅受代谢途径中结构基因的控制，还受到转录因子和激素信号网络的紧密调控。特别是AP2/ERF、WRKY、NAC和MYB等转录因子家族已被确定为连接发育线索和环境信号与代谢输出的关键调控因子。植物激素，尤其是茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET），在调控果实成熟和次生代谢中发挥核心作用。然而，在番石榴果实发育过程中，特别是与挥发性生物合成相关的JA和ET介导信号通路之间的时间协调和潜在相互作用仍知之甚少。尽管已有若干研究表征了不同番石榴品种的挥发性组成，但果实发育过程中品种特异性香气形成的分子机制在很大程度上仍未得到探索。特别是，跨发育阶段代谢途径的动态重编程及其与转录调控和激素信号的协调，尚未得到系统研究。这一空白制约了对风味形成机制的理解，并阻碍了改善果实品质的分子育种策略。为解答这些问题，研究人员首先鉴定了商业采收阶段成熟果实中导致对比香气特征的品种特征性挥发性香气物质（VACs）。随后，研究了这些特征性VACs在三个果实发育阶段的积累模式。进一步整合代谢组学和转录组学分析，以阐明品种特异性香气形成背后的潜在生物合成途径、调控模块和候选基因。通过整合代谢组学和转录组学数据集，本研究旨在表征果实发育过程中的挥发性动态变化，鉴定品种特异性香气差异背后的关键代谢途径，并阐明涉及激素信号和转录因子的潜在调控网络。这项工作为理解番石榴香气形成的调控架构提供了框架，并鉴定了未来功能验证和育种应用的候选基因。
番石榴果实挥发性香气生物合成的多组学解析及其发育调控机制
一、研究背景与科学问题
果实香气是决定消费者偏好和果实商品价值的关键品质性状之一，其本质是果实发育过程中多种挥发性香气物质（volatile aroma compounds，VACs）的程序化合成与积累结果。番石榴（Psidium guajava L.）作为重要的热带和亚热带经济水果，其果实富含维生素C、膳食纤维、类胡萝卜素和多酚类化合物，兼具营养品质与潜在健康功效。果实香气主要由酯类、醛类、醇类、萜类化合物及苯丙烷衍生物等复杂混合物决定，这些物质通过脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途径、甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径、甲基赤藓醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途径以及苯丙烷代谢途径等多条相互关联的代谢通路合成。已有研究表明，番石榴不同品种间的挥发性物质谱存在显著差异，遗传背景在决定香气特征中起主导作用。然而，现有研究多聚焦于成熟果实的静态比较或采后变化，果实发育过程中香气生物合成的动态调控机制仍知之甚少。特别是，不同发育阶段代谢途径的动态重编程及其与转录调控和激素信号的协调关系尚未被系统探索。这一研究空白制约了对风味形成机制的理解，也阻碍了通过分子育种改良果实品质的策略制定。为此，研究人员选取了具有对比香气特征的‘四季桃’（果香型）和‘珍珠桃’（草本香型）两个番石榴品种，系统研究了果实发育过程中挥发性物质的动态变化及其分子调控机制。
二、研究内容与主要结论
本研究首先鉴定了商业采收阶段（75 DAF）两个番石榴品种中导致香气差异的品种特征性VACs，随后考察了这些特征性VACs在三个发育阶段（61、68、75 DAF）的积累轨迹。通过整合代谢组学与转录组学分析，研究人员阐明了品种特异性香气形成背后的潜在生物合成途径、调控模块和候选基因。研究共鉴定出52种VACs，分为萜类、酯类、醛类、烷烃类、芳香烃类、醇类等七大类，其中萜类化合物最为丰富（25种，占48.08%），酯类次之（10种，占19.23%）。主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）表明，品种是影响VACs组成变异的主导因素。‘四季桃’果实发育过程中呈现从“青香”到“甜香”的风味转变，早期以萜类化合物为主贡献“木质香”，中后期酯类和脂肪酸衍生物显著积累，赋予果实特征性果甜香；而‘珍珠桃’在整个发育过程中始终保持以萜类化合物为主的稳定风味组成，呈现草本/青香特征。代谢组学分析进一步揭示，‘四季桃’中苯甲酸甲酯在中后期特异性积累，表明苯丙烷代谢途径对风味分化有重要贡献。转录组学分析显示，‘四季桃’的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）数量远多于‘珍珠桃’，且KEGG富集分析表明‘四季桃’主要富集于脂肪酸衍生物和苯丙烷衍生物合成途径，而‘珍珠桃’主要富集于倍半萜和单萜合成途径。激素信号分析揭示了JA和ET信号通路在果实发育过程中的时序性调控模式：‘四季桃’早期激活JA信号，后期激活ET信号，呈现JA-ET序贯模式；‘珍珠桃’则在中期出现JA和ET信号的协同爆发，与萜类化合物的爆发性积累相吻合。加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）鉴定出两个与特征性VACs显著相关的模块，其中turquoise模块富集了倍半萜和三萜生物合成途径、植物激素信号转导及MAPK信号通路相关基因，并从中筛选出AP2/ERF、WRKY、NAC等转录因子作为调控香气合成的候选因子。
三、关键技术与方法
研究人员采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）技术对两个番石榴品种（‘四季桃’和‘珍珠桃’，采自中国广东省湛江市廉江市河唇镇番石榴果园）在三个发育阶段（61、68、75 DAF）的果实样品进行挥发性物质定性与定量分析，以2-辛醇为内标。转录组测序采用链特异性文库构建和Illumina平台双端150 bp测序，原始数据已提交至中国国家生物信息中心OMIX数据库（登录号OMIX021164）。生物信息学分析包括Fastp数据过滤、Trinity转录本组装、DIAMOND和HMMER功能注释、RSEM表达定量、DESeq2差异表达分析、KEGG和GO富集分析、iTAK转录因子注释以及WGCNA共表达网络构建。
四、研究结果
4.1 番石榴果实发育过程中VACs的整体谱图分析
研究人员在‘四季桃’和‘珍珠桃’两个品种的3个发育阶段中共鉴定出52种VACs，分为7大类。萜类化合物最为丰富（25种，48.08%），其次是酯类（10种，19.23%）、醛类（7种，13.46%）、烃类（5种，9.62%）和醇类（3种，5.77%）。20种VACs在所有样品中均被检测到，构成番石榴果实的核心香气谱。12种VACs仅在‘四季桃’中被鉴定到，其中大部分为酯类（7种），表明酯类化合物的特异性积累可能是‘四季桃’特征性甜香的核心代谢基础。PCA分析显示品种、发育阶段和样品三个变量分别解释了28.3%、24.8%和22.3%的方差，品种是主导因素。
4.2 商业采收阶段品种特征性VACs的鉴定
通过PLS-DA和VIP分析，研究人员鉴定出C16（顺式-α-红没药烯）、C27（壬醛）和C10（1S-α-蒎烯）为品种特征性候选VACs。发育阶段间的风味演变主要受C23（双环[3.1.1]庚烷，6,6-二甲基-2-亚甲基-，（1S）-）、C27（壬醛）和C36（(Z)-3-己烯-1-醇丙酸酯）影响，而品种间的风味分化主要由C10（1S-α-蒎烯）、C16（顺式-α-红没药烯）和C14（α-荜澄茄烯）决定。‘四季桃’的风味组成呈现明显的时间转变，早期以C23贡献“木质香”，成熟后被C8（3-己烯-1-醇）取代，赋予“青果香”；‘珍珠桃’的风味谱在各阶段高度依赖C10（1S-α-蒎烯），保持稳定一致的风味组成。
4.3 候选特征性VACs的发育轨迹
‘四季桃’中酯类的多样性和含量在中期发育阶段明显增加，酯类种类从3种增至8种，总含量从0.07 μg/kg升至0.22 μg/kg，最终在后期达到0.44 μg/kg。与此同时，萜类和芳香烃类化合物水平显著下降。相比之下，‘珍珠桃’在整个发育过程中VACs组成保持稳定，总含量在中期达到峰值后下降，未观察到酯类的主导积累。这些结果表明，酯类合成动力学是‘四季桃’和‘珍珠桃’香气差异的关键代谢特征。
4.4 差异代谢物积累分析
基于PLS-DA模型，两个品种间鉴定出24个显著差异代谢物（VIP>1，p<0.05，|log?FC|≥1）。‘四季桃’在3个发育阶段检测到21个差异VACs，早期主要积累贡献“木质香”的萜类化合物，中后期贡献“果香”的化合物（如苯甲酸甲酯、3-己烯-1-醇丙酸酯、壬醛和(E)-2-己烯醛）显著增加，呈现从“青香”到“甜香”的风味转变。‘珍珠桃’仅鉴定出6个差异VACs，除10S,11S-himachala-3(12),4-diene外，萜类水平在中期积累后下降，风味始终保持“青草香”。值得注意的是，苯甲酸甲酯在‘四季桃’中后期特异性积累，表明苯丙烷代谢途径对风味分化有重要贡献。
4.5 转录组测序与分析
转录组测序结果显示所有样品错误率0.02%-0.03%，Q30≥94%，生物学重复间相关系数0.87-0.99，数据质量可靠。PCA显示PC1和PC2分别解释24.07%和10.84%的总方差，样品清晰分离，表明品种和发育阶段是转录组变异的主要因素。
4.5.1 差异表达基因全局谱图与代谢通路导向分析
在严格阈值（padj<0.05，|log?FC|≥1）下，‘四季桃’的DEGs数量多于‘珍珠桃’，且在早期和晚期发育阶段动态变化最大。KEGG富集分析显示，‘四季桃’主要富集于脂肪酸衍生物合成途径和苯丙烷衍生物合成途径，而‘珍珠桃’主要富集于倍半萜和单萜合成途径。
4.5.2 关键香气生物合成途径限速基因的协调变化
4.5.2.1 萜类生物合成途径及相关基因表达分析
在‘四季桃’中，10个萜类代谢物在早期水平较高、后期下降。早期特异性上调的基因涵盖MVA途径多个关键节点，包括羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因（Cluster-32,160.1、Cluster-32,160.2、Cluster-32,160.3、Cluster-33,986.0）和甲羟戊酸激酶（MK）基因（Cluster-30,871.2、Cluster-30,871.4），以及下游香叶基二磷酸合酶（GPPS）基因（Cluster-32,218.1）。HMGR是MVA途径最关键的限速酶，其广泛上调与早期萜类生物合成增强相关。同时，异戊烯基二磷酸δ-异构酶（IDI）、2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶（MCT）、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶（HDS）、乙酰辅酶A C-乙酰转移酶（AACT）及法尼基二磷酸合酶（FPPS）基因（Cluster-32,113.6）显著下调。结果表明‘四季桃’早期萜类积累主要与MVA途径活性增强相关，MEP途径贡献相对有限。进入中期后，萜类合成基因整体表达水平急剧下降，与萜类水平显著下调的代谢表型完全一致。相比之下，‘珍珠桃’的萜类合成基因变化相对有限，中期仅AACT（Cluster-3035.0）和GPPS（Cluster-32,218.1）显著上调，多个下游合成基因（GGPPS、MK、HMGS）明显下调；从中期到后期，萜类生物合成途径几乎停滞，AACT和HMGS的显著下调限制了萜类合成。
4.5.2.2 脂肪酸衍生物生物合成途径及相关基因表达分析
‘四季桃’中脂肪酸衍生物的积累呈现明显的时间动态：早期以3-己烯-1-醇和己基过氧化物为主，中期以己醛和3-己烯-1-基丙酸酯为主，后期以壬醛和(E)-2-己烯醛为主。早期LOX途径被激活，共102个脂肪酸代谢相关基因差异表达。LOX3（Cluster-18,981.4）上调而同工酶LOX6（Cluster-21,967.1、Cluster-21,967.3）显著下调，表明LOX3亚型在早期表达贡献最强。从头脂肪酸合成的限速酶乙酰辅酶A羧化酶/生物素羧化酶1（ACC1，Cluster-17,811.0）和分泌型磷脂酶A2（sPLA?，Cluster-25,190.0）同时显著上调。LOX3与下游醇脱氢酶（ADH，Cluster-25,405.2）的协同上调与C6醛类、醇类及其衍生物的合成相关。中期基因表达谱发生显著转变，从头脂肪酸合成途径关键基因（AACT、KAS III、KAS II、CAC3）保持活跃，确保香气化合物合成所需前体充足供应。茉莉酸O-甲基转移酶（JMT，Cluster-31,208.0）的显著上调被认定为茉莉酸信号通路的关键信号。醛脱氢酶家族7成员A1（ALDH7A1，Cluster-30,695.4、Cluster-30,695.8）的上调将醛氧化为羧酸，减少醛积累并为酯化反应提供潜在羧酸前体。后期脂肪酸代谢相关基因表达谱重塑，从头脂肪酸合成和β-氧化两条平行途径为香气化合物合成提供多样化代谢来源。KAS III、KAS II和酰基-酰基载体蛋白脱饱和酶（SAD）基因（Cluster-7339.1）协调上调，表明内源脂肪酸合成过程活跃。β-氧化途径作为壬醛等香气化合物的直接合成途径，其限速酶酰基辅酶A氧化酶（ACX，Cluster-25,613.9）、末端酶乙酰辅酶A酰基转移酶1（ACAA1，Cluster-17,601.0、Cluster-27,043.8、Cluster-27,043.9）以及烯酰辅酶A水合酶（ECH，Cluster-19,983.0）均上调，表明后期β-氧化途径代谢通量显著增强，促进长链脂肪酸降解为中短链酰基辅酶A，为壬醛和(E)-2-己烯醛生物合成提供关键前体。在‘珍珠桃’中，代谢基因在中期上调，包括AACT（Cluster-3035.0）、[酰基载体蛋白]S-丙二酰转移酶（MCAT，Cluster-26,050.1）、KAS II（Cluster-26,594.0、Cluster-26,594.3）、脱饱和酶SAD（Cluster-7339.1）和ALDH7A1（Cluster-30,695.6、Cluster-30,695.8），但β-氧化途径多个关键基因（ACAA1、MFP、ADH）受到抑制。
4.5.2.3 苯丙烷衍生物生物合成途径及相关基因表达分析
‘四季桃’中源自苯丙烷代谢的关键香气化合物呈现明显的时间积累模式。苯乙烯在早期阶段特异性积累且仅存在于‘四季桃’，苯甲酸甲酯在中期显著积累。与代谢动态相对应，苯丙烷代谢途径相关基因在早期和中期发生显著重编程。早期与晚期相比，65个苯丙烷代谢相关基因差异表达，最显著的上调是肉桂醇脱氢酶（CAD，Cluster-20,787.1）和10个过氧化物酶（POD，Cluster-33,789.0）基因，为苯乙烯的早期积累提供了合理的分子基础，因为POD可催化肉桂醇的氧化脱羧产生苯乙烯。同时，木质素单体合成相关基因（PAL、C4H、F5H、CCoAOMT）显著下调，表明与果实生长发育相关的S/G型木质素合成在早期受到抑制。研究人员推测，在木质素生物合成受抑条件下，升高的CAD活性促进积累的上游前体（如肉桂酸）转化为肉桂醇，随后为大量激活的下游POD提供充足底物，共同增强苯乙烯香气的生成。中期‘四季桃’以苯环芳香族化合物为主，主要是苯甲酸甲酯。此阶段特异性激活了4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL，Cluster-24,286.0）、CCoAOMT（Cluster-21,464.0、Cluster-21,464.2、Cluster-21,464.3）、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶（HCT，Cluster-21,484.0）和咖啡酰莽草酸酯酶（CSE，Cluster-27,713.5、Cluster-27,713.6、Cluster-32,757.0）等基因。HCT基因的特异性上调表明苯丙烷代谢途径可能是导致苯甲酸生成的关键分支，其上调可能有助于香气谱从“青香”向“甜香”转变。相比之下，‘珍珠桃’的苯丙烷途径整体活性较低，相关基因（POD、4CL、HCT）在各发育阶段均未上调，与苯丙烷衍生物缺乏积累的现象一致。
4.5.3 激素信号分析
共鉴定出623个与植物激素信号转导相关的差异表达基因，其中茉莉酸和乙烯途径变化显著。‘四季桃’早期果实发育阶段观察到茉莉酸信号通路相关表达变化，关键基因茉莉酸-氨基酸合成酶（JAR1，Cluster-23,977.2）显著上调，而乙烯信号通路在早期被显著抑制，乙烯受体（Cluster-27,699.1、Cluster-33,427.10-13）、信号组分乙烯不敏感蛋白2（EIN2，Cluster-25,447.5）和核心转录因子乙烯不敏感蛋白3（EIN3，Cluster-13,398.0、Cluster-22,676.0、Cluster-28,440.0）均下调。中期EIN3上调，但EIN3结合F-box蛋白（EBF1，Cluster-16,367.0、Cluster-26,987.0）也上调，表明乙烯信号通路激活可能仍受抑制。后期乙烯信号通路被强烈激活，乙烯受体ETR2（Cluster-33,427.13）和核心转录因子EIN3（Cluster-13,398.0、Cluster-22,676.0）显著上调，构成典型的乙烯响应模式。综上，‘四季桃’果实发育过程呈现潜在的激素相关时序模式：早期激活茉莉酸信号与代谢重编程相关，后期激活乙烯信号与成熟过程相关，这种JA-ET序贯信号模式可能有助于风味化合物的有序积累和转化。在‘珍珠桃’中，早期茉莉酸和乙烯信号均受抑制，茉莉酸信号通路的关键抑制因子茉莉酸ZIM结构域蛋白（JAZ，Cluster-15,188.3、Cluster-15,188.4、Cluster-19,697.0、Cluster-19,697.1、Cluster-33,322.2）和EBF1（Cluster-26,987.0、Cluster-14,245.0）显著上调。进入中期，1S-α-蒎烯和10S,11S-himachala-3(12),4-diene大量积累，信号格局发生根本转变，JA和ET通路同时激活：JAR1（Cluster-23,977.6）显著上调，JAZ表达下调表明抑制解除，EBF1显著下调并结合乙烯响应因子ERF1（Cluster-14,245.0、Cluster-27,258.0）上调构成完整的乙烯信号响应级联。‘珍珠桃’在中期出现茉莉酸和乙烯信号的协同爆发，与萜类化合物的爆发性积累完全一致。值得注意的是，‘珍珠桃’中JA/ET信号可能通过抑制竞争性代谢途径（如MVA途径和脂肪酸合成）增强MEP途径的代谢通量，增加质体萜类生产的碳骨架和还原当量可用性，在结构基因未显著上调的情况下有效激活现有酶系统的催化潜力。此外，‘珍珠桃’中JA生物合成途径（如氢过氧化物脱水酶AOS）在系统水平上受到转录抑制，表明植物在果实成熟过程中优先将资源分配给风味化合物（萜类）的合成而非激素的持续生产，从而在竞争性途径间最大化代谢资源利用效率。‘四季桃’在中期采用苯丙烷主导的香气代谢策略，与‘珍珠桃’以萜类为中心的代谢特征形成鲜明对比，反映了不同番石榴品种在果实成熟过程中精确调控不同代谢途径以塑造独特香气谱的品种特异性。
4.5.4 共表达网络分析
通过WGCNA将非冗余DEGs聚类为21个主要模块。鉴定出两个与候选特征性VACs积累模式显著相关的模块：红色模块（MEred）与香气含量高度相关，主要富集于“真核生物核糖体生物发生”通路，代表基础细胞结构和生长能力，其活性可能与果实发育过程中的蛋白质合成能力相关，从而间接显著影响最终香气化合物的积累；turquoise模块（MEturquoise）富集了更多已知的香气合成结构基因编码基因，主要富集于倍半萜和三萜生物合成途径，同时高度富集于“植物激素信号转导”和“植物MAPK信号通路”，表明该模块与香气发育相关的激素响应过程相关联。基于turquoise模块内连通性和基因显著性排名，筛选出前25个核心转录因子。结果表明，‘四季桃’中有6个转录因子与香气合成关键基因显著相关，包括1个AP2/ERF-ERF、2个WRKY、2个NAC和1个HB-BELL；‘珍珠桃’中仅发现1个AP2/ERF-ERF转录因子。共表达网络显示这些转录因子与香气合成相关基因紧密互连，可能代表与番石榴香气形成相关的候选调控因子。
五、讨论与结论
研究人员提出了番石榴果实发育过程中香气形成的潜在调控模型：在早期发育阶段，茉莉酸相关信号模式与MVA途径活性相关，促进单萜和倍半萜积累，奠定基础木质香谱；随着果实发育推进，从茉莉酸到乙烯信号的激素转变与协调的代谢重编程相关，导致萜类生物合成下调和苯丙烷及脂肪酸衍生挥发性途径的激活，促进酯类和醛类化合物积累，赋予成熟果实特征性果甜香。在转录水平上，AP2/ERF、WRKY和NAC转录因子被鉴定为与挥发性生物合成相关的潜在调控候选因子，可能与萜类、脂肪酸和苯丙烷生物合成中关键结构基因的表达模式相关，从而协调挥发性谱的时间转变。这种层级调控凸显了果实香气形成不仅由代谢途径活性决定，还由跨发育阶段的激素和转录重编程的协调决定。尽管转录组数据集在生物学重复间表现出高重现性和一致性，但本研究鉴定候选基因的功能验证仍有必要。未来涉及qRT-PCR验证和遗传操作的研究将进一步确认其在调控挥发性香气生物合成中的作用。
