Cnestis ferruginea VaHL ex DC 根（Connaraceae）中 β-sitosterol 与 Daucosterol 的抗微生物及耐药修饰活性研究

《Scientific African》：Antimicrobial activities of isolated bioactive compounds from Cnestis ferruginea VaHL ex DC roots (Connaraceae): The case of β-sitosterol and Daucosterol

　　

Cnestis ferruginea 根具有抗微生物特性。研究人员通过逐步操作程序，测定了提取物和分离物的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）。研究人员从 Cnestis ferruginea 根中分离并表征了 β-sitosterol 和 daucosterol。研究人员通过逐步操作程序，测定了耐药修饰活性，包括对所选常规抗微生物活性的高达 16 倍增强。

抗微生物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）日益威胁全球健康，削弱抗微生物药物疗效，因此需要发现新的治疗剂或佐剂。药用植物是生物活性化合物的重要来源，许多抗生素来源于天然产物；但抗生素发现速度放缓，耐药菌仍不断出现。将抗生素与耐药修饰剂联合，是恢复现有药物疗效的策略之一，此类佐剂常来自天然产物，可靶向外排泵（efflux pumps）或生物膜（biofilm）等耐药机制。Cnestis ferruginea 为 Connaraceae 科药用植物，分布于热带非洲，传统用于感染、伤口、炎症性皮肤病、卵巢疾病、复杂性流产、咽喉痛和偏头痛等，并已有抗微生物等生物活性报道。然而，其抗微生物及耐药修饰活性成分的科学探索有限。其根粗甲醇提取物在初步研究中显示抗微生物活性，因此研究人员采用生物测定导向分级分离，分离抗微生物化合物，并评估其对 Escherichia coli、Streptococcus pyogenes、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae、Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus 和 Candida albicans 的抗微生物及耐药修饰特性，以应对全球 AMR 危机。

技术方法方面，研究人员从 University of Cape Coast, Ghana（CC-140-7474）采集 Cnestis ferruginea 根，并在 Kwame Nkrumah University of Science and Technology（KNUST）鉴定，凭证标本为 KNUST/HM1/2018/R005。根皮干燥粉碎后以绝对甲醇冷浸提，得到粗提物 CFMc；经柱色谱依次用石油醚、乙酸乙酯、甲醇分级，得到 CFPeF、CFEaF、CFMeF。采用杯碟法和微量肉汤稀释法测定抗微生物活性与最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC），并测定最低杀菌浓度/最低杀真菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration/Minimum Fungicidal Concentration, MBC/MFC）。以生物测定导向分级分离，通过硅胶柱色谱、薄层色谱（Thin Layer Chromatography, TLC）和重结晶分离 D1、D2；用傅里叶变换红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FTIR）及核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）中的 ¹H-NMR 和 ¹³C-NMR 鉴定结构；用亚抑菌浓度组合实验计算分数抑菌浓度（Fractional Inhibitory Concentration, FIC）。测试菌来自 Pharmaceutics Department, FPPS, KNUST, Ghana，包括 Escherichia coli（ATCC 25922）、Pseudomonas aeruginosa（ATCC 4853）、Enterococcus faecalis（Clinical strain）、Staphylococcus aureus（ATCC 25923）、Streptococcus pyogenes（Clinical strain）、Klebsiella pneumoniae（Clinical strain）和 Candida albicans（Clinical strain）。

研究结果如下。Plant collection：植物采集于 University of Cape Coast, Ghana 的 William Amo Road，使用 Cnestis ferruginea 根。Susceptibility testing of plant fractions (Cup plate method)：杯碟法显示 CFMc 具有抗微生物活性；CFEaF 和 CFPeF 在工作浓度无活性；CFMeF 对测试菌显示多种活性，最大抑菌圈记录于 CFMeF 对 Enterococcus faecalis。Ciprofloxacin 和 Ketoconazole 阳性对照具有活性。Susceptibility testing of plant fractions using the microbroth dilution method：微量肉汤稀释法显示 CFEaF 和 CFPeF 在工作浓度无活性；CFMeF 对测试菌的 MIC 为 10 至 0.63 mg/mL，其中对 Enterococcus faecalis、Klebsiella pneumoniae 和 Candida albicans 的 MIC 为 0.63 mg/mL，提示 CFMeF 具有广谱抗微生物活性。Identification of compounds：D1 为白色无定形粉末，熔点为 135-139°C，Liebermann-Burchard 植物甾醇试验阳性，IR、¹H-NMR 和 ¹³C-NMR 数据与文献比较后鉴定为 (3β)-Stigmast-5-en-3-ol，即 β-sitosterol。D2 为白色无定形固体，熔点为 270-278°C，IR 显示 -OH、C=O 及 C-O 等吸收，NMR 数据与文献一致，鉴定为 β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside，即 Daucosterol。Susceptibility and resistance-modifying assays of D1 and D2：D1 对 Candida albicans 和 Enterococcus faecalis 的最低 MIC 为 32 μg/mL；D1 对 Pseudomonas aeruginosa 的 MIC 未确定，且大于 1024 μg/mL；D2 对 Streptococcus pyogenes、Pseudomonas aeruginosa 和 Candida albicans 的 MIC 未能确定，且大于 1024 μg/mL。MIC determination of D1 and D2：D1 的 MIC 范围为 32 至 1024 μg/mL；D2 对部分测试菌的 MIC 为 64 至 1024 μg/mL，总体活性弱于 D1。MBC or MFC to MIC ratio：原文报告除 D2 对 Klebsiella pneumoniae 的 MBC/MIC 大于 4 外，其余计算比值小于 4；讨论据此解读 D1 对测试菌表现为抑菌作用，D2 仅对一种菌表现为杀菌作用。Susceptibility and resistance-modifying assays of D1 and D2：亚抑菌浓度 D1、D2 与 Amoxicillin、Ciprofloxacin 组合后，D1 活性总体高于 D2。D1 多表现协同作用（synergy, FIC≤0.5），尤其对 Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae 和 Enterococcus faecalis，MIC 降低可达 16 倍；Ciprofloxacin 与 D1 对 Klebsiella pneumoniae 的协同最强，FIC=0.06。D2 多表现相加（additive, 0.5
讨论部分总结：本研究旨在分离 Cnestis ferruginea 根皮中负责抗微生物活性的化合物。生物测定导向分级分离成功分离出 β-sitosterol（D1）和 Daucosterol（D2）。CFMeF 活性最强，提示主要抗微生物成分集中于极性甲醇部分，并具有广谱抗微生物活性。β-sitosterol 表现出广谱抗微生物活性，MIC 范围为 32 至 1024 μg/mL；其与既往 MIC 差异可能受菌株、实验条件、方法及样品组成影响。虽未研究作用机制，但原文提及分子对接研究显示 β-sitosterol 可与 Staphylococcus aureus 和 Pseudomonas aeruginosa 结合位点及 MurA、SrtA、DHFR 等相互作用，抗真菌可能涉及 Sap5 和 CYP51。Daucosterol 是 β-sitosterol 的糖苷化衍生物，具有多种生物活性，但抗菌报道不一致；本研究中 D2 活性弱，可能因糖基增加极性、分子大小和位阻，降低其进入疏水微生物膜或接近靶点的能力。D2 对 Candida albicans 无活性，文献中亦无其体外抗真菌报道，但免疫调节活性可能与传统应用相关。MBC/MIC 解读提示 D1 主要为抑菌，D2 仅对一种菌为杀菌。组合实验显示 D1 可协同增强抗生素活性，尤其对 Klebsiella pneumoniae，D2 较弱，且无拮抗。研究结论翻译：研究人员从 Cnestis ferruginea 根皮中分离出具有抗微生物和微生物耐药修饰活性的 β-sitosterol（D1）和 Daucosterol（D2）。这突显了天然产物作为独立治疗剂或联合治疗佐剂的潜力。然而，β-sitosterol 和 Daucosterol 的相对较高最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）使其不适合作为独立抗生素，而适合作为佐剂。