苹果MdIAA8基因过表达调控番茄植株生长、果实形态并诱导单性结实的研究

《Scientia Horticulturae》：Overexpression of apple MdIAA8 in tomato alters plant growth and fruit shape and induces parthenocarpy

　　

苹果（Malus domestica）是温带地区广泛栽培的重要经济果树，富含矿物质、维生素及其他营养物质（Duan et al., 2017）。其生长发育过程受植物激素生长素（auxin）调控（Quint and Gray, 2006; Teale et al., 2006）。在分子水平上，生长素调控植物生长发育相关基因的表达（Za?ímalová et al., 2014）。生长素信号转导通路涉及两大蛋白家族，即生长素响应因子（Auxin Response Factors, ARFs）和Aux/IAA蛋白（Andrew and Bonnie, 2005; Liu et al., 2006）。ARFs调控生长素响应基因、GH3及SAUR的转录（Liscum and Reed, 2002; Gretchen and Tom, 2002; Mukesh et al., 2006），并通过控制生长素信号通路中的表达来调控植物生长发育（Devoghalaere et al., 2012）。 Aux/IAA蛋白是短寿命的转录调控因子，包含四个保守结构域，分别命名为I、II、III和IV（Chen et al., 2018; Liscum and Reed, 2002; Edgar, 2004; Singh and Jain, 2015）。结构域I通过与TPL支架蛋白相互作用介导转录抑制，招募组蛋白去乙酰化酶以抑制基因活性，并将ARFs转化为抑制子（Wang et al., 2019）。结构域II作为蛋白降解的泛素化靶位点，通过与SCF/TIR复合物相互作用实现降解（Szemenyei et al., 2008; Tiwari et al., 2004）。结构域III和IV在Aux/IAA与ARF蛋白之间保守，负责与ARF激活子C端区域异源二聚化，使复合物能够响应生长素信号（Lin et al., 2020; Tiwari et al., 2001）。 在拟南芥中，多个Aux/IAA基因已被鉴定，为生长素介导的发育调控提供了见解。IAA1/AXR5突变体表现出向性、叶形态和花序发育缺陷（Park et al., 2002; Yang et al., 2004），而IAA3/SHY2突变体表现出根和茎生长模式的改变（Tian and Reed, 1999）。IAA6/SHY1（Kim et al., 1996）、IAA7/AXR2（Nagpal et al., 2000）和IAA17/AXR3（Rouse et al., 1998）的突变影响向地性生长、器官伸长、不定根形成、叶片大小和颜色以及整体植株结构。IAA12/BDL参与胚胎发生和根分生组织起始（Hamann et al., 2002），而IAA14/SLR（Fukaki et al., 2002）、IAA19/MSG2（Tatematsu et al., 2004）和IAA28（Rogg et al., 2001）抑制侧根发育。IAA18已被鉴定调控根形成和子叶发育（Reed, 2001）。这些研究表明Aux/IAA蛋白具有不同的发育功能。 在苹果中，MdAux/IAA2调控细胞数量和果实大小（Bu et al., 2022）。在番茄中，SlIAA9的下调影响叶形态、坐果和顶端优势（Wang et al., 2005, 2009）。SlIAA3表达降低改变顶端优势、生长素响应和顶端钩发育（Chaabouni et al., 2009a, b）。类似地，马铃薯中StIAA2的抑制增加株高、叶柄偏上性和叶片弯曲（Kloosterman et al., 2006）。这些发现表明Aux/IAA蛋白在植物营养和生殖发育中具有保守且特异的功能。 植物激素调控坐果和果实发育，其中生长素发挥特别重要的功能（Fos et al., 2001）。生长素施用诱导单性结实（parthenocarpy）首先在番茄中得到证实（Gustafson and Houghtaling, 1939），随后在黄瓜、梨、西瓜、柑橘、葡萄、秋葵和油棕中得到验证（Serrani et al., 2007; Lu et al., 2016; Qian et al., 2018; Cong et al., 2019; Hossain et al., 2021）。细胞分裂素处理也能通过增加果实内源IAA水平同时降低ABA水平来改变果实激素稳态（Cong et al., 2020）。此外，高单性结实品系中的生长素水平高于低单性结实品系（Su et al., 2021）。参与生长素代谢的基因，包括生物合成、运输和信号转导，调控单性结实。例如，生长素合成基因YUCCA10和生长素受体SlTIR1的过表达诱导单性结实发育（Li et al., 2014; Jiang et al., 2016）。此外，GH3的下调和ARF8A/8B、ARF7、ARF5及IAA9的缺失也诱导单性结实果实形成（Chen et al., 2017; Hu et al., 2022; Liu et al., 2018; Goetz et al., 2007; Wang et al., 2005）。 等位基因特异性表达（allele-specific expression, ASE）是指在调控因子作用下特定等位基因的优先表达，导致表型变异的产生（Gaur et al., 2013）。ASE分析使研究人员能够在相同的遗传背景和环境条件下，从同一数据集中比较同一样本内不同等位基因的表达水平，为鉴定具有功能意义的遗传变异提供了更可靠的方法（Tian et al., 2022）。ASE已在作物物种中得到广泛研究，为驯化过程中的调控变化（Bao et al., 2019）、杂种优势机制（Shao et al., 2019）以及非生物胁迫适应相关基因（Zhou et al., 2022）提供了见解。在果树中，ASE与苹果花色等性状相关联（Tian et al., 2022）。然而，ASE调控Aux/IAA基因在苹果花和果实发育过程中的遗传机制仍不清楚。 在本研究中，研究人员揭示了Aux/IAA家族基因MdIAA8（MD08G1207300）调控苹果植株生长、果实形态和单性结实的功能。该基因在‘Royal Gala’苹果花组织中表现出等位基因特异性表达，并在不同苹果品种间存在差异表达。MdIAA8在番茄植株中的过表达改变了植株生长、果实形态和花结构，促进了单性结实果实发育。这些发现为苹果生长素响应基因的发育功能提供了新见解，并突显了其对果实生长发育的潜在贡献。

论文解读

一、研究背景与科学问题

苹果（Malus domestica）是温带地区广泛栽培的重要经济果树，其生长发育受植物激素生长素的精细调控。在分子层面，生长素信号转导通路涉及生长素响应因子（Auxin Response Factors, ARFs）和Aux/IAA蛋白两大蛋白家族。Aux/IAA蛋白作为生长素信号通路中的转录抑制因子，包含四个保守结构域（I、II、III和IV），通过与ARFs异源二聚化及SCF/TIR复合物介导的泛素化降解，实现对生长素响应基因的精密调控。在拟南芥中，多个Aux/IAA基因已被鉴定出在向性生长、侧根发育、胚胎发生和花器官形成等过程中发挥特异功能。在苹果、番茄和马铃薯等作物中，Aux/IAA同源基因也已被证实参与调控果实大小、坐果和顶端优势等农艺性状。生长素在坐果和果实发育中发挥核心作用，外源生长素施用可诱导多种作物单性结实（parthenocarpy），即不经授粉受精而形成无籽果实的现象。已有研究表明，YUCCA10过表达、SlTIR1过表达、GH3下调以及ARF8A/8B、ARF7、ARF5和IAA9的缺失均可诱导单性结实。然而，关于Aux/IAA基因在苹果花和果实发育中的功能，尤其是等位基因特异性表达（allele-specific expression, ASE）对Aux/IAA基因调控的遗传机制，仍缺乏深入研究。基于此，研究人员开展了对苹果Aux/IAA家族基因MdIAA8的系统功能研究，旨在阐明其在植株生长、果实形态和单性结实中的潜在作用。

二、研究内容与主要结论

本研究以苹果MdIAA8基因（MD08G1207300）为研究对象，通过系统发育分析、表达谱分析、等位基因特异性表达分析和番茄异源过表达功能验证，揭示了该基因在苹果花和果实发育中的潜在功能。主要结论包括：MdIAA8在苹果各组织中广泛表达，其表达水平在气球期花中高于开放花，且在不同苹果品种间存在显著差异；MdIAA8在‘Royal Gala’（RG）苹果花中表现出显著的等位基因特异性表达，RG等位基因表达量约为GD等位基因的3倍；MdIAA8在番茄中的异源过表达导致植株矮化、根长增加和侧根增多，同时改变花器官发育，诱导单性结实，并导致果实变小、形态改变和细胞结构变化。这些发现表明MdIAA8在植物营养生长和生殖发育中具有重要调控功能，为苹果无籽果实品种的分子育种提供了潜在靶点。

三、关键技术与方法

研究人员从中国郑州新乡苹果试验田（113.78°E，35.13°N）采集‘Royal Gala’（RG）、‘华寿’（HS）、‘红脆宝’（HCB）、‘寒富’（HF）和‘金冠’（GD）等苹果品种的花和果实样本，以及四种野生苹果属物种的成熟果皮样本。RNA-seq数据分别来源于美国国家生物技术信息中心（NCBI）和国家基因组科学数据中心数据库，利用Hisat2将序列比对至GDDH13.1参考基因组，采用等位基因差异表达比率（allele differential expression ratio, ADER）阈值（大于0.75或小于0.25）结合二项式检验鉴定ASE基因。利用MEGAX软件以邻接法构建系统发育树。通过农杆菌介导法将CaMV35S启动子驱动的MdIAA8编码序列转化至Micro-tom番茄，获得T3代转基因过表达株系OE1和OE2。采用qRT-PCR验证转基因表达水平，通过形态学测量和组织切片染色分析植株和果实表型。

四、研究结果

4.1 MdIAA8的系统发育与转录谱分析

系统发育分析将MdIAA8（MD08G1207300）归入IAA8/IAA9分支，与MdIAA8b（MD15G1391700）亲缘关系最近，推测二者为全基因组复制事件产生的旁系同源基因。多序列比对显示，来自李属、葡萄属、草莓属、拟南芥、苹果属和茄属的IAA8类蛋白均含有四个高度保守的Aux/IAA结构域。表达分析表明，MdIAA8在苹果树皮、气球期花、开放花、全果、果肉、果皮和果核等所有检测组织中均高表达，而其旁系同源基因MdIAA8b主要在树皮中表达。MdIAA8在四种野生苹果和三个栽培品种的成熟果皮中也均高表达，且在整个果实发育期（花后1至20周）持续表达，表明其可能具有广泛的发育调控功能。

4.2 MdIAA8在‘Royal Gala’苹果花中表现出等位基因特异性表达

通过将RG基因组序列比对至RGTH1参考基因组，研究人员在MdIAA8编码区鉴定出三个单核苷酸多态性（SNP），据此区分出两个等位基因，即GD等位基因（MD08G1207300）和RG等位基因（RG08g6562）。三个核苷酸差异导致三个氨基酸替换，但均不位于四个保守的Aux/IAA结构域内。等位基因特异性表达分析显示，在RG花中，约75%的RNA-seq读段来自RG等位基因，25%来自GD等位基因，显著偏离预期的1:1比例（二项式检验，P<0.001），表明RG等位基因在RG花中优先表达，其表达量约为GD等位基因的3倍。

4.3 MdIAA8表达在不同花发育阶段和苹果品种间存在差异

MdIAA8在气球期花中的表达水平高于开放花，该模式在多个苹果品种中一致。在成熟果实中，MdIAA8在‘华寿’（HS）和‘红脆宝’（HCB）中表达较高，在‘寒富’（HF）中中等表达，在‘金冠’（GD）中表达较低。在4周龄幼果中也观察到品种依赖性差异，M9中表达较高而GD中表达较低。qRT-PCR分析进一步证实了不同品种开放花中MdIAA8转录本丰度的差异。

4.4 MdIAA8过表达降低番茄株高但增加根长

研究人员利用35S:MdIAA8过表达载体获得了5个转基因番茄株系，选取OE1和OE2两个独立株系进行表型分析。qRT-PCR确认了两个株系在花、根和果实中均有高水平的MdIAA8转录本。与野生型（WT）相比，OE1和OE2在花后30天（DAA）株高显著降低，主根更长且侧根数量更多。

4.5 MdIAA8过表达改变果实发育并诱导番茄单性结实

OE1和OE2果实远端形成约2-3毫米的伸长尖端，而WT果实无可检测尖端。转基因株系种子数量较WT显著减少。去雄实验表明，去雄的WT花未能坐果，而OE1和OE2去雄花发育出无籽果实，坐果率分别为33%和30%，坐果频率差异具有统计学显著性（χ2=12.14，df=2，P=0.0023）。OE1和OE2在28 DAA时果实重量显著低于WT，果实形状指数（FSI）也显著小于WT，且FSI差异在7 DAA时已显现并基本稳定至果实成熟。

4.6 MdIAA8过表达改变花器官发育

与WT相比，转基因株系花表现出雄蕊和雌蕊伸长、花瓣长度和花直径改变等花器官发育异常。转基因株系在开花前即启动子房生长和果实发育，与其早熟坐果能力一致。花形态改变伴随柱头与雄蕊相对位置的变化，可能干扰自花授粉。

4.7 MdIAA8过表达降低果实细胞大小并增加细胞密度

组织学分析显示，WT果实含有较大、形状不规则且具有明显细胞间隙的细胞，而OE1和OE2果实含有较小、排列更紧密且细胞间隙减少的细胞。定量分析证实，OE1和OE2果实细胞显著小于WT，单位面积细胞数量显著多于WT，表明MdIAA8过表达限制细胞扩张，导致果实变小和形态改变。

五、讨论与结论

本研究表明，MdIAA8在RG花中表现出显著的等位基因特异性表达，RG等位基因表达量约为GD等位基因的3倍，提示两个等位基因受差异转录调控。三个编码区多态性导致的氨基酸替换均位于保守结构域之外，暗示调控差异可能与其功能分化更相关，但因果调控变异和蛋白功能差异仍有待确定。MdIAA8在气球期花中高表达且在不同品种间存在差异，结合其在早期果实果肉中的相对高表达，支持其参与苹果花和果实发育的潜在作用。MdIAA8在番茄中的异源过表达导致株高降低、根长增加和侧根增多，与已知Aux/IAA基因在茎和根发育中的功能一致。去雄实验证明MdIAA8过表达可在无授粉受精条件下促进果实起始，结合转基因果实种子数减少，证实其诱导单性结实的能力。花器官形态改变可能降低自花授粉效率，进一步贡献于种子减少。果实变小与细胞扩张受限相关，但细胞密度增加不能直接证明细胞增殖增强，因为细胞变小本身会增加单位面积细胞数，细胞分裂速率和总细胞数未被直接测定。研究人员指出，本研究采用CaMV 35S启动子驱动的组成型异源过表达策略，绕过了MdIAA8在苹果中的天然时空和定量调控，可能产生不能完全反映其在苹果中生理功能的多效性表型。苹果MdIAA8蛋白与番茄内源调控组分的相互作用也可能存在差异。因此，转基因表型证明了MdIAA8高表达的发育后果，但不应被解释为内源MdIAA8在苹果中调控所有这些性状的直接证据。然而，两个独立转基因株系主要表型的可重复性，结合MdIAA8在苹果中的发育表达模式，支持其参与营养和生殖发育的潜在作用。未来研究应开展激素谱分析、鉴定MdIAA8-ARF调控模块，并在苹果天然调控背景下进行MdIAA8功能分析，特别是比较RG和GD等位基因的功能差异，以确立其在苹果花和果实发育中的生理作用。