Sarcocephalobixin：一种来源于宽叶帽柱木（Nauclea latifolia Sm.）的新型DPPH自由基清除剂与抗疟原虫类胡萝卜素——体外研究、分子对接、分子动力学及类药性预测

《South African Journal of Botany》：Sarcocephalobixin, a novel DPPH radical scavenger and antiplasmodial apocarotenoid from Nauclea latifolia Sm .: in vitro studies, molecular docking, molecular dynamics and drug-likeness prediction

　　

Sarcocephalobixin，一种来源于宽叶帽柱木（Nauclea latifolia Sm.）的新型DPPH自由基清除剂与抗疟原虫类胡萝卜素——体外研究、分子对接、分子动力学及类药性预测 疟疾仍然是全球最严重的寄生虫病之一，尤其在热带和亚热带地区。该病由疟原虫（Plasmodium）属寄生虫引起，通过受感染的雌性按蚊（Anopheles）叮咬传播。在感染人类的五种疟原虫（P. falciparum、P. vivax、P. malariae、P. ovale 和 P. knowlesi）中，恶性疟原虫（P. falciparum）导致的病例最为严重且致死率最高。据世界卫生组织（WHO）统计，疟疾每年仍造成数亿人感染和超过60万人死亡，主要集中在撒哈拉以南非洲地区。尽管以青蒿素为基础的联合疗法（ACTs）等有效抗疟药物已投入使用，但耐药性恶性疟原虫（P. falciparum）株的出现和传播，特别是在东南亚和非洲地区，仍然是疟疾防控的重大挑战。此外，蚊媒对常用杀虫剂产生抗性进一步增加了疾病管理的复杂性。这一现状凸显了开发具有新作用机制且对耐药寄生虫株具有活性的新型抗疟药物的迫切需求。天然产物仍是抗疟药物候选物的重要来源，多种临床使用的抗疟药物源自植物。此外，疟疾感染与寄生虫发育过程中过量产生活性氧（ROS）所导致的氧化应激相关，提示兼具抗疟原虫和抗氧化特性的化合物可能提供额外的治疗益处。 宽叶帽柱木（Nauclea latifolia Sm.，异名Sarocephalus latifolius (Sm.) Bruce，茜草科Rubiaceae）是一种广泛分布于撒哈拉以南非洲的灌木，传统上用于治疗疟疾及其他感染性疾病。前期研究已报道该植物提取物具有抗疟、抗炎和镇痛活性。植物化学研究揭示了其含有多种次生代谢产物，包括三萜类、甾醇类、皂苷类、吲哚生物碱和黄酮类。其中部分化合物已显示出对药物敏感和耐药恶性疟原虫（P. falciparum）株的抗疟原虫活性。此外，恶性疟原虫（P. falciparum）的遗传多样性和突变能力要求持续评估天然化合物对不同寄生虫株的活性。再者，土壤成分、气候和海拔等环境因素可能影响药用植物的植物化学特征，导致不同地理位置的生物活性代谢物存在差异。在此背景下，考虑到对采自喀麦隆的宽叶帽柱木（N. latifolia）的植物化学研究仍然有限，本研究旨在从宽叶帽柱木（N. latifolia）中分离并表征次生代谢产物，评估其对恶性疟原虫（P. falciparum）3D7株（敏感）和Dd2株（多重耐药）的体外抗疟原虫活性及其抗氧化潜力。此外，研究人员进行了分子对接研究，以考察分离化合物对恶性疟原虫（P. falciparum）两种关键酶——半胱氨酸蛋白酶FP-2（PDB：3bpf）和二氢乳清酸脱氢酶（PfDHODH，PDB：7kz4）的结合亲和力。为评估选择性，研究人员还针对相应的人类同源蛋白进行了对接。此外，研究人员进行了分子动力学（MD）模拟，以进一步评估蛋白质-配体复合物在生理条件下的稳定性和动态行为。这种双靶点策略可能有助于识别具有多种作用机制和改善选择性的化合物，从而降低耐药性发展的可能性。

宽叶帽柱木（Nauclea latifolia Sm.）新型类胡萝卜素Sarcocephalobixin的发现及其抗疟与抗氧化活性研究解读**

一、研究背景与科学问题

疟疾作为全球最严重的寄生虫传染病之一，每年仍导致数亿人感染和超过60万人死亡，其中以撒哈拉以南非洲地区受害最为严重。尽管以青蒿素为基础的联合疗法（ACTs）已广泛使用，但恶性疟原虫（P. falciparum）耐药株的出现与扩散，尤其是在东南亚和非洲地区，已成为疟疾防控面临的核心挑战。同时，蚊媒对常用杀虫剂的抗性进一步加剧了疾病管理难度。因此，开发具有新作用机制、对耐药株有效的抗疟药物迫在眉睫。天然产物历来是抗疟药物的重要来源，多种临床抗疟药物均源自植物。此外，疟疾感染伴随寄生虫发育过程中活性氧（ROS）过量产生所引发的氧化应激，提示兼具抗疟原虫与抗氧化活性的化合物可能具有额外的治疗价值。宽叶帽柱木（Nauclea latifolia Sm.，又名Sarocephalus latifolius (Sm.) Bruce，茜草科Rubiaceae）是广泛分布于撒哈拉以南非洲的传统药用灌木，民间长期用于治疗疟疾等感染性疾病。前期研究已报道其提取物具有抗疟、抗炎和镇痛活性，并从中鉴定出三萜、甾醇、皂苷、吲哚生物碱和黄酮等多种次生代谢产物。然而，针对采自喀麦隆的该植物进行系统的植物化学研究仍十分有限。基于此，本研究旨在系统分离和表征宽叶帽柱木（N. latifolia）的次生代谢产物，评估其对药物敏感株（Pf3D7）和多重耐药株（PfDd2）的体外抗疟原虫活性及抗氧化能力，并通过分子对接和分子动力学模拟探讨其与恶性疟原虫（P. falciparum）关键靶酶的结合机制与选择性，为新型抗疟药物先导化合物的发现提供科学依据。

二、主要技术方法

研究人员采集了采自喀麦隆极北地区Mayo-Tsanaga省Tchanawa地区的宽叶帽柱木（N. latifolia）茎皮和根木，经植物学鉴定后，采用乙酸乙酯（EtOAc）和甲醇（MeOH）依次室温浸提获得粗提物。通过硅胶柱色谱（CC）和Sephadex LH-20凝胶柱色谱等分离纯化手段，结合核磁共振（NMR，包括1H NMR、13C NMR、COSY、HSQC、HMBC）和质谱（ESI-MS/MS）等波谱技术鉴定化合物结构。体外抗疟原虫活性采用基于SYBR Green I荧光的96孔板法，分别针对恶性疟原虫（P. falciparum）3D7和Dd2株进行评价；抗氧化活性采用DPPH自由基清除实验测定。分子对接研究使用AutoDockTools（ADT）和AutoDock4的Lamarckian遗传算法（GA 4.2），针对恶性疟原虫（P. falciparum）半胱氨酸蛋白酶FP-2（PDB：3bpf）、二氢乳清酸脱氢酶（PfDHODH，PDB：7kz4）及其人类同源蛋白进行对接。分子动力学（MD）模拟采用OpenMM 8.3.1软件，以Amber ff14SB力场和GAFF2力场分别描述蛋白质和配体，在TIP3P水盒子中进行141 ns的模拟，并采用MM-GBSA方法估算结合自由能。ADMET和类药性预测分别使用ADMETlab 3.0在线服务器和SwissADME服务器完成。

三、研究结果

3.1 化合物分离与结构鉴定

研究人员从宽叶帽柱木（N. latifolia）茎皮和根木中系统分离获得7个次生代谢产物。其中，化合物1为首次从天然来源中发现的新型线性C₂₆类胡萝卜素（apocarotenoid），命名为sarcocephalobixin，其分子式为C₂₆H₃₂O₄，结构为(2E,4E,6E,8E,10E,12E,14E,17E,19E)-21-甲氧基-4,8,13,18-四甲基-21-氧代二十一碳-2,4,6,8,10,12,14,17,19-九烯酸，属于全反式构型的线性共轭多烯结构，含有一个甲酯基和一个羧基。与已知的β-红木素（β-bixin）相比，该化合物在C-16位多出一个亚甲基单元。其余6个已知化合物分别鉴定为27-羟基芒果酸（2）、狭缝酰胺（strictosamide，3）、10-羟基狭缝酰胺（4）、奎诺酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、奎诺酸3-O-β-D-吡喃岩藻糖苷（6）和奎诺酸3-O-β-D-吡喃岩藻糖基-28-β-D-吡喃葡萄糖酯（7）。

3.2 化合物1的生合成探讨

从生合成角度分析，化合物1可合理视为红木素（bixin）衍生的类胡萝卜素。红木素由番茄红素经类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）氧化裂解产生。然而，化合物1在C-16位多出的亚甲基单元无法用标准的红木素生合成途径解释，因为CCD酶催化的氧化裂解不改变碳骨架。研究人员提出一种非经典的修饰过程，涉及自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基转移酶催化的单碳插入反应，通过自由基机制在多烯骨架上引入孤立亚甲基。该假设尚需直接的生化表征或同位素标记实验验证，目前视为推测性结论。

3.3 抗疟原虫活性

体外活性评价显示，所有测试样品（两种提取物和7个化合物）对Pf3D7和PfDd2株均表现出抑制活性，IC₅₀值均低于50 μg/mL。其中，狭缝酰胺（3）活性最强，对PfDd2和Pf3D7的IC₅₀分别为4.3±0.4 μg/mL和3.0±0.3 μg/mL；10-羟基狭缝酰胺（4）也表现出显著活性，IC₅₀分别为6.2±0.5 μg/mL和5.2±0.9 μg/mL。两者均属于β-咔啉生物碱类，与已知抗疟药物奎宁的化学类别一致。其余化合物活性中等，IC₅₀范围为31.2±0.7至38.9±1.7 μg/mL。所有化合物的活性均显著低于阳性对照青蒿素（PfDd2：0.3 μg/mL；Pf3D7：0.1 μg/mL）。值得注意的是，本研究是除狭缝酰胺外其余化合物对Pf3D7和PfDd2株抗疟活性的首次报道。

3.4 DPPH自由基清除活性

DPPH实验结果显示，宽叶帽柱木（N. latifolia）的EtOAc和MeOH粗提物均表现出良好的自由基清除活性，IC₅₀分别为0.64±0.01和0.79±0.01 μg/mL，但低于阳性对照抗坏血酸（0.11±0.00 μg/mL）。在分离化合物中，化合物2活性最强（IC₅₀=0.24±0.01 μg/mL），其次为化合物1（0.39±0.01 μg/mL）、4（0.48±0.01 μg/mL）和3（0.54±0.01 μg/mL）。化合物1的高活性归因于其共轭多烯体系和末端羧酸功能基团；化合物4因含游离羟基而比化合物3更具抗自由基活性。这些结果证实宽叶帽柱木（N. latifolia）富含抗氧化成分。

3.5 分子对接研究

针对恶性疟原虫（P. falciparum）半胱氨酸蛋白酶FP-2（3bpf）的对接结果显示，化合物3具有最优结合亲和力（-7.1 kcal/mol），优于共结晶配体E64（-4.4 kcal/mol），主要通过CYS42、ASN81、GLY83、HIS174等残基的常规氢键以及TYR78的π-π堆积作用实现。化合物1的得分（-4.3 kcal/mol）与E64接近。化合物5、6、7则呈现不利的正得分值，表明与FP-2活性位点结合不良。针对PfDHODH（7kz4）的对接中，除化合物7外所有化合物均显示有利的负得分值，其中化合物1（-9.2 kcal/mol）和2（-9.1 kcal/mol）接近共结晶配体XC7（-10.2 kcal/mol），化合物3为-7.6 kcal/mol。选择性评估显示，化合物1对人类同源蛋白3of9（-5.7 kcal/mol）和3ovz（-5.8 kcal/mol）的亲和力显著低于对寄生虫靶标的亲和力，表现出良好的选择性潜力；而化合物3对人类同源蛋白的亲和力较高（3of9：-8.0 kcal/mol；3ovz：-7.8 kcal/mol），选择性欠佳。针对人类DHODH同源蛋白2wv8，化合物1（-4.6 kcal/mol）、2（-4.0 kcal/mol）和3（-7.9 kcal/mol）均显示弱结合，提示潜在的选择性。

3.6 分子动力学模拟

基于综合证据，研究人员选择化合物3与3bpf复合物进行141 ns的分子动力学模拟。RMSD收敛分析表明复合物在模拟过程中达到稳定状态。MM-GBSA结合自由能估算进一步支持了化合物3与FP-2的稳定结合。

3.7 ADMET与类药性预测

ADMET预测结果显示，化合物2具有较好的类药性，满足Lipinski规则（1个违例），胃肠道吸收为高，生物利用度评分为0.85。化合物1的LogP为3.84，TPSA为63.6 ?2，但部分ADMET参数未完全预测。化合物3和4虽具有良好活性，但氢键供体和受体数量较多（分别为5/10和6/11），TPSA较大（144.71和164.94 ?2），胃肠道吸收为低，生物利用度评分分别为0.56和0.11。所有化合物均预测为非CYP酶抑制剂，Ames致突变性和致癌性风险较低。

四、讨论与结论

本研究首次从宽叶帽柱木（N. latifolia）中分离获得新型C₂₆类胡萝卜素sarcocephalobixin（1），并系统评价了7个化合物的抗疟原虫和抗氧化活性。狭缝酰胺（3）和10-羟基狭缝酰胺（4）表现出最强的抗疟原虫活性，验证了该植物传统抗疟用途的科学基础。分子对接和分子动力学模拟揭示化合物1对PfDHODH具有高结合亲和力和良好的选择性，尽管其体外抗疟活性中等，但可能受限于生理屏障或生物利用度因素，仍可作为设计更具渗透性PfDHODH抑制剂的结构模板。化合物3对FP-2表现出优于共结晶配体的结合亲和力，但其对人类同源蛋白的高亲和力提示选择性需进一步优化。ADMET和类药性预测表明化合物2具有较好的口服生物利用度潜力。本研究存在一定局限性，包括未评估化合物对哺乳动物细胞系的细胞毒性，因此无法确定选择性指数（selectivity index），后续需开展细胞毒性实验以全面评估安全性和治疗潜力。综上所述，本研究为宽叶帽柱木（N. latifolia）的传统抗疟用途提供了科学证据，所分离化合物为新型抗疟和抗氧化药物先导物的开发提供了有价值的结构基础，未来可通过结构-活性关系（SAR）研究和化学优化进一步提升其成药性。