深度学习赋能的时间延迟RESOLFT纳米显微成像

《Nature Communications》：Time-lapse RESOLFT nanoscopy empowered by deep learning

　　

捕获细胞内蛋白质与细胞器之间的动态互作，需要兼具高空间分辨率与高时间分辨率的显微方法。可逆可饱和光学荧光跃迁（Reversible Saturable OpticaL Fluorescent Transition，RESOLFT）利用图案化光与可逆切换荧光探针，在活细胞纳米显微成像中展现出重要潜力。尽管切换探针与光学方案持续改进，时间延迟成像的时长与帧率仍受光漂白与空间采样步长限制。研究人员提出两种基于深度学习的策略，用于恢复低信噪比（Signal-to-Noise Ratio，SNR）或欠采样图像，从而拓展RESOLFT的实验边界。研究人员证明分层多样性去噪（Hierarchical DivNoising，HDN）可在监督与无监督条件下恢复低SNR的RESOLFT数据并保持全空间分辨率，使每帧光剂量降低10倍、成像时间延长至最多5倍。研究人员进一步提出Fast-MoNaLISA，可降低任意点扫描系统的采集时间，使帧率提高4倍并减少扫描伪影。上述方法为亚细胞器水平动态数据采集提供了新可能，例如完整线粒体的囊泡出芽，以及肌动蛋白网状结构形成与解聚。

研究背景方面，荧光纳米显微术（nanoscopy）使亚细胞组织可视化取得革命性进展，但在活细胞中以亚70 nm空间分辨率监测分子动态仍受光漂白与采集速度限制。多数亚70 nm技术依赖荧光蛋白在ON-OFF态之间转换以产生分子稀疏性，其中可逆切换荧光蛋白（reversibly switchable fluorescent proteins，rsFPs）因可用较低光强切换，适合活细胞成像。RESOLFT利用rsFPs实现全细胞时间延迟成像，但rsFPs的光切换疲劳会限制观察时长；同时时间分辨率受切换、激发与扫描位置数制约，按Nyquist-Shannon采样准则，采样密度越高，采集时间越长。因此，在保持纳米分辨率前提下降低光剂量、提高时间分辨率，是活细胞纳米显微术的重要问题。

论文发表在《Nature Communications》。研究人员以并行化RESOLFT实现MoNaLISA为平台，开展两项计算成像研究：一是用HDN进行低ON-switching图像去噪，二是用Fast-MoNaLISA进行欠采样图像重建，从而延长成像时长并提升帧率。

主要关键技术方法方面，研究人员使用固定U2OS细胞内源表达vimentin-rsEGFP2、LifeAct-rsEGFP2样本，以及活HeLa细胞表达HIV Gag-IM-rsEGFP2、活U2OS细胞表达rsEGFP2-Omp25样本；以MoNaLISA获取配对与未配对数据集；采用HDN及其监督版HDN^sup进行去噪，利用实验噪声模型与阶梯变分自编码器（Ladder Variational Autoencoder，LVAE）保持分辨率；采用UNet-RCAN进行单帧与多帧欠采样上采样训练，并从Nyquist采样图像随机剔除像素以模拟快速采集。

研究结果部分，Restore of low ON-switching images with HDN：研究人员将ON-switching比例降至10-20%，用HDN与HDN^sup恢复低SNR图像，FWHM分别约56 nm与54 nm，接近高质量靶标58 nm；无监督SN2N、N2V及监督CARE、UNet-RCAN均出现平滑与分辨率下降，证明HDN框架在监督与无监督下均能保分辨率。

Prolonged time-lapse MoNaLISA imaging：研究人员用HDN^sup处理约10倍低光剂量活细胞记录，光漂白显著降低，vimentin内源表达下成像时长延长至约5倍；线粒体外膜标记下无监督HDN可超过100帧；actin meshwork可连续观测至少50帧，每5 s一帧。

Fast-MoNaLISA–single-frame training：研究人员以采样比S=75%、50%、25%对应帧率提升1.3、2、4倍，从完全采样图像生成欠采样输入；UNet-RCAN在S=50%时兼顾速度与保真度最好，S=25%仍可恢复主要信息但弱结构易丢失，高SNR下效果最佳。

Fast-MoNaLISA–multi-frames training：研究人员用N=3、5、7帧时间上下文预测中间帧T₀；vimentin与线粒体数据N=5最优，Gag-IM数据N=7最优；时间上下文改善线粒体衍生囊泡（mitochondria-derived vesicles，MDVs）与丝状结构连续性，减少单帧把暗弱囊泡误当噪声剔除的问题。

Fast-MoNaLISA enables monitoring of rapid mitochondrial dynamics：研究人员以S=25%与5帧预测进行2D全视场约35×35 μm²成像，帧率达2 Hz，为常规4倍；可观测80-200 nm、持续1.5-4 s的快速膜突起；3D体积成像达0.5-1 Hz，能追踪MDV出芽、接触、再融合过程，检测到的线粒体-MDV互作至少约为常规MoNaLISA的3倍。

讨论部分总结方面，研究人员指出该混合计算-实验方案可实现全细胞高空间分辨率（x-y约60 nm）、2D约2 Hz、3D体积0.5-1 Hz的时间延迟成像，扩大并行化RESOLFT可观测结构范围。相比SIM、SOFI、STED等方法，并行化RESOLFT在分辨率、速度、视场与光剂量间更具平衡优势。HDN可用于各类显微数据去噪，Fast-MoNaLISA适用于任何逐点扫描且像素对应确定扫描位置的系统，如STED与spinning-disk confocal。研究人员也提醒，ON-switching与采样比需按SNR和动力学验证；HDN潜空间多样性当前靠经验调节，未来可自动化；去噪与上采样联合框架是重要方向。

研究结论部分译为：总之，研究人员提出了一种混合计算-实验方法，能够以高空间分辨率（x-y约60 nm）提供全细胞时间延迟成像，2D下帧率约2 Hz，3D下体积速率0.5-1 Hz，为从细胞骨架到线粒体囊泡的多种结构增添了新的成像能力。更长时长与更高帧率的时间延迟成像，拓展了并行化RESOLFT活细胞纳米显微术可观测结构范围，包括此前只能快照显示的暗弱结构，以及需在3D中长时间监测的快速运动分子。