多发性对称性脂肪瘤病（MSL）患者脂肪源性干细胞（hASCs）分泌组的个体内配对功能与蛋白质组学初步分析：细胞外基质重塑和PI3K/AKT-ERK增殖信号趋势

《Scientific Reports》：Pilot intraindividual secretome profiling of adipose-derived stem cells in multiple symmetric lipomatosis

多发性对称性脂肪瘤病（multiple symmetric lipomatosis, MSL）是一种罕见的脂肪组织疾病，特征为进行性、非包膜性、对称性脂肪堆积。其病理生理学仍未完全明确。在此，研究人员首次对来自 n=15 例患者（蛋白质组学发现队列 n=5）受病变影响和未受病变影响区域的人脂肪源性干细胞（human adipose-derived stem cells, hASCs）分泌组进行了个体内配对比较。受影响的 MSL-hASCs 倾向于表现出代谢信号加速、细胞密度更高，并保留成脂分化能力。受影响 MSL-hASCs 的分泌组转移在 24 h 后使野生型 hASCs（wild-type hASCs, wt-hASCs）的代谢活性在 4/7 份样本中显著增加（均为探索性 Benjamini-Hochberg 校正后 p = 0.040）。自下而上蛋白质组学分析鉴定出 811 种蛋白质，其中 220 种被归类为分泌型。13 种蛋白质表现出名义显著的表达失调，包括 CALR（p = 0.0061）、LAMC1（p = 0.0241）、S100A7（p = 0.0281）和 HDGF（p = 0.0474），但在应用 Benjamini-Hochberg（BH）校正以控制错误发现率（false discovery rate, FDR）为 0.05 后，无一保持显著。通过实时定量逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction, rt-qPCR）进行的转录验证显示 hLAMA4 和 hCFB 呈下调趋势（两者 p = 0.0625）。总之，趋同模式与细胞外基质重塑及 PI3K/AKT-ERK 相关增殖信号一致。该模型支持 MSL 中祖细胞水平失调而非单一克隆驱动因素的假说，但仍需在更大队列中进行进一步机制验证。

研究背景与问题：多发性对称性脂肪瘤病（multiple symmetric lipomatosis, MSL）是一种以脂肪组织过度增殖为特征的罕见疾病，表现为非触痛、进行性脂肪组织体积增加，主要位于颈部，也可累及肩部、躯干和近端肢体。患者报告外观毁损及整体健康受损。该病最初被认为良性，但近期报告提示可因纵隔肿块效应导致严重气道和大血管压迫，并存在恶性转化为脂肪肉瘤的风险。19世纪首次描述后，MSL在欧洲人群中得到研究和分类；Schiltz et al. 于2018年根据最常受累区域进一步亚分类。尽管临床表型已被较广泛描述，其病因仍不清楚，临床管理主要集中于症状缓解，如脂肪抽吸或脂肪切除，而非病因治疗。手术可暂时改善，但复发率高，且复发率似乎因脂肪切除或脂肪抽吸的具体部位而异。因此，理解MSL发病机制可能促进更有效长期治疗。光镜研究提示受影响与未受影响区域组织组成存在差异：一些研究发现MSL组织更实、更纤维化、更血管化，另一些未能确认，并描述小 hASCs 的非包膜增殖和向外周脂肪扩散，提示MSL为增殖性疾病而非肥厚性疾病。部分作者报告组织样本采集方法未显示所获干细胞数量的统计学显著差异。已有研究提出线粒体DNA突变和环境因素如酒精滥用参与MSL。近期研究显示，健康 hASCs 暴露于MSL分泌组后生长行为和表面标志发生改变。研究人员假设受影响区域 hASCs 的差异蛋白分泌谱导致 Caponnetto et al. 观察到的变化，并可能与增强的增殖信号和局部细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑相关。为检验该假设，研究人员开展了系列实验，包括同一MSL患者受影响与未受影响区域 hASCs 分泌组的配对个体内比较，以促进对MSL病理生理学的理解，并为扩展遗传和蛋白质组研究提供起点。

研究人员开展的研究与结论：研究人员进行了首个同一患者个体内 hASCs 分泌组分析，结合功能试验、鸟枪法蛋白质组学和 qPCR。研究对象来自15例独立、假匿名人类供者，其中9名女性和6名男性；按 Donhauser 的 Madelung 分型为 I：5、II：7、III：3。参考组织取自前臂，一例取自小腿。结论提示，趋同模式与ECM重塑及 PI3K/AKT-ERK（磷脂酰肌醇3-激酶/AKT-细胞外信号调节激酶）相关增殖信号一致；该模型支持MSL中祖细胞水平失调而非单一克隆驱动因素，但仍需更大队列机制验证。其意义在于，该研究为迄今MSL中首个且最大的个体内分泌组分析，提供关于活化增殖相关信号和ECM改变的新假设。

关键技术方法：研究人员在治疗性脂肪抽吸或脂肪切除时获取受影响和未受影响的皮下脂肪组织，分离 hASCs，并使用前六代细胞。收集无血清 α-MEM 条件培养基24 h，进行 resazurin 功能测定以评估 wt-hASCs 代谢活性；对配对样本进行串联质谱蛋白质组学分析，鉴定分泌蛋白并依据 UniProt 进行亚细胞定位分类；对候选基因进行 rt-qPCR 验证，采用 2^-ΔΔCt 方法并以 hGAPDH 为内参。统计分析使用 R，蛋白质组采用配对 t 检验，resazurin 信号采用双侧精确 Mann-Whitney-U 检验，qPCR 采用双侧精确 Wilcoxon 符号秩检验，并以 Benjamini-Hochberg（BH）法校正多重检验。样本队列来源包括功能试验 Type 1 n=3对、Type 2 n=3对、Type 3 n=1对；蛋白质组发现队列 n=5对；qPCR 每个基因 n=5或 n=10对。

研究结果：
hASCs 的分离、形态学鉴定与表征：所有病例培养三天后成功分离 hASCs，使用前六代确保表型稳定。MSL未受影响和受影响区域 hASCs 均呈特征性成纤维样、纺锤形形态，但光镜下未检测到明显形态差异。两组经成脂诱导后均均匀形成胞内脂滴，Oil Red O 染色证实。未受影响与受影响样本成脂分化后无可见差异。值得注意的是，在换液时，从MSL受影响组织分离的 hASCs 持续形成更密集、更小的干细胞群体，而未受影响参考组织来源细胞与之不同。

hASC 代谢活性对分泌组暴露的功能表征：研究人员用 resazurin 还原为试卤灵来测定 wt-hASCs 暴露于MSL-hASCs 上清24 h后的代谢活性。7对样本的结果显示对不同上清存在差异反应。4例患者（MSL Type 1 n=2，MSL Type 2 n=2）在暴露于受影响 MSL-hASCs 上清时 resazurin 信号显著升高（各未校正 p = 0.029，BH校正 p = 0.0400）。2例患者两种上清间无显著差异。唯一MSL Type 3患者呈相反情况：未受影响 MSL-hASCs 上清存在时 resazurin 信号更高（分别为148.81 vs. 75.30 RFU）。这些结果仅反映技术重复的检验，应视为探索性。

差异蛋白表达：联合分析所有分泌组共鉴定811种蛋白质。基于倍数变化的分类显示，91.7%（n=744）的蛋白质在MSL受影响与未受影响上清中表达相似，5.8%（n=47）在受影响组织中富集（FC > 1.5），2.5%（n=20）在未受影响组织中富集（即在受影响组织中降低，FC < 0.5）。719种蛋白质可获得亚细胞定位信息；其中胞内蛋白占76.4%（n=549），膜相关蛋白占27.4%（n=197），分泌蛋白占30.6%（n=220），后者称为分泌组。以名义显著性 p < 0.05 分析差异丰度蛋白，13种蛋白质名义显著，占分泌组5.9%；但经 BH 校正后无一保持统计学显著（最小校正 p = 0.554）。受影响组中4种上调、9种下调。上调蛋白中，钙网蛋白（CALR）p值最低（p = 0.00609；log₂FC = +0.335；FC幅度 = 1.26）；下调蛋白中，含清道夫受体富含半胱氨酸结构域蛋白（SSC5D/SRCRL）p值最低（p = 0.016；log₂FC = -0.782；FC幅度 = 1.72）。受影响 MSL-hASCs 显示分泌型促分裂原上调，包括肝癌衍生生长因子（HDGF；p = 0.047；log₂FC = +0.645；FC幅度 = 1.56）、髓系衍生生长因子（MYDGF；p = 0.039；log₂FC = +0.558；FC幅度 = 1.47）和应激及增殖相关蛋白 S100-A7（Psoriasin；p = 0.028；log₂FC = +0.870；FC幅度 = 1.83）。相反，多种ECM相关蛋白在受影响 MSL-hASCs 中显著下调，包括基底膜成分层粘连蛋白γ1链（LAMC1；p = 0.024；log₂FC = -0.806；FC幅度 = 1.75）、血浆蛋白酶C1抑制剂（SERPING1；p = 0.031；log₂FC = -1.291；FC幅度 = 2.45）、抗纤维化糖蛋白乳脂肪球EGF因子8（MFGE8；p = 0.031；log₂FC = -0.812；FC幅度 = 1.76）和卵泡抑素（FST；p = 0.028；log₂FC = -0.821；FC幅度 = 1.77）。集落刺激因子1（CSF1；p = 0.030；log₂FC = -0.498；FC幅度 = 1.41）和 Vasorin（VASN；p = 0.044；log₂FC = -0.353；FC幅度 = 1.28）在MSL分泌组中降低。细胞外超氧化物歧化酶（SOD3；p = 0.021；log₂FC = -0.718；FC幅度 = 1.65）在受影响 MSL-hASCs 中显著下调。生物素酶（BTD；p = 0.034；log₂FC = -0.619；FC幅度 = 1.54）同样降低。名义显著差异蛋白中识别出三个生物学相关簇，分别涉及生存信号、ECM重塑和结构完整性，以及氧化应激和脂质代谢。除显著 LAMC1 外，分泌组结果提示基底膜成分层粘连蛋白β1（LAMB1，p = 0.059）、IV型胶原（COL4A1，p = 0.066）和集聚蛋白（AGRN，p = 0.062）呈细微但一致的下调。CALR上调与SOD3下调共同提示可能存在氧化应激或内质网应激。

转录验证：为在转录水平验证分泌组发现，研究人员对13个候选基因在配对的MSL受影响/未受影响样本中进行 rt-qPCR（每个基因 n=5或 n=10，取决于三次重复数据可用性）。基因表达差异（ΔΔCt）使用配对 Wilcoxon 符号秩检验评估，并统一应用于所有基因。无基因达到名义显著性（p ≥ 0.05），BH FDR校正后也无基因保持显著。观察到 CFB（log₂FC = -1.75，p = 0.063，FDR = 0.406）和 LAMA4（log₂FC = -2.11，p = 0.063，FDR = 0.406）探索性下调趋势，随后为 PAPPA（log₂FC = -2.16，p = 0.125，FDR = 0.542）和 MMP1（log₂FC = -3.03，p = 0.188，FDR = 0.609），其中 MMP1 在所有检测基因中倍数变化幅度最大。其余基因无相关调控：PTEN（log₂FC = -0.62，p = 0.312）、PCOLCE2（log₂FC = -1.97，p = 0.438）、HDGF（log₂FC = -0.82，p = 0.557）、CLTA（log₂FC = -0.11，p = 0.625）、HSPB1（log₂FC = -0.47，p = 0.625）、IL-6（log₂FC = -0.08，p = 0.770）、CLCA（log₂FC = -0.39，p = 0.812）和 PPARγ（log₂FC = -0.05，p = 1.000）。S100A7 是唯一呈上调趋势的基因（log₂FC = +0.39，p = 0.625）。跨平台比较显示 HDGF 存在转录后不一致：分泌组中上调（FC幅度 = 1.56，p = 0.047），但 mRNA 表达呈非显著降低趋势（log₂FC = -0.82，p = 0.557）。S100A7 在 mRNA（log₂FC = +0.39，p = 0.625）和蛋白水平（分泌组：FC幅度 = 1.83，p = 0.028）均呈方向一致但非显著上调。层粘连蛋白α4链（LAMA4）mRNA 水平的非显著降低趋势（p = 0.0625）与分泌组中层粘连蛋白γ1链（LAMC1）显著下调（p = 0.024）一致。

讨论总结：MSL是一种孤儿病和进行性皮下脂肪组织疾病，即使采用脂肪抽吸或脂肪切除等既定治疗，仍常见复发，并对患者功能和社会心理健康造成不利影响。研究人员的研究是首个对同一患者受影响和未受影响区域 hASCs 分泌组进行的个体内分析，结合功能试验、鸟枪法蛋白质组学和 qPCR。核心 hASC 特征得到生物学确认：MSL hASCs 形成典型成纤维样形态，两类样本成脂分化相当，Oil Red O 染色显示。与既往实验观察一致，受影响细胞表现出更高细胞密度，受影响 hASCs 更早达到更高密度并呈更小表型。这些发现支持MSL发生中的祖细胞病因模型。既往关于MSL-hASCs 米色/棕色样特征的报告也与更高细胞可塑性和适应性通路激活模型一致。与既往研究相比，研究人员使用更短孵育期研究受影响和未受影响 hASC 分泌组效应。resazurin 反应在个体患者样本间存在差异；小样本和技术重复不允许对MSL类型差异得出结论，但旁分泌调节能力似乎在受影响 Type 1和Type 2分泌组中最明显。由于研究的初步性质，这些发现需在更大队列中验证。蛋白质组比较中个别蛋白达到名义显著性，但候选蛋白均未通过 FDR 校正；研究人员将此归因于样本量较小，这在孤儿病MSL的发现蛋白质组学范围内可以解释。鉴于初步性质，研究主要是假设生成，关注趋同趋势和共享模式。在此局限内，结果与受影响 hASCs 以 ECM/基底膜、生长/生存信号和基质重塑为中心的轴一致。最突出的相应模式是多种层粘连蛋白链趋同下调。LAMC1（γ1）与 AKT 依赖性代谢重编程相关，在分泌组中名义降低，而 LAMA4（α4）在分泌组和 qPCR 验证两个实验系列中表现一致趋势。PAPPA 在两个平台也呈一致方向下调，但转录水平不显著，分泌组分析中 p > 0.05。该金属蛋白酶切割胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin-like growth factor binding proteins, IGFBPs），从而调节局部胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）生物利用度。PAPPA活性降低可能导致 IGFBP-4 和 IGFBP-5 切割减少，从而降低局部 IGF-1 生物利用度。由于 IGF-1 负责 hASCs 的增殖、成脂和迁移，其局部生物利用度降低可能反映对过度增殖的补偿反应，或自分泌反馈破坏；这种假设机制与数据集中更广泛的 ECM 失调一致。尽管这些发现均未达到常规显著性阈值，但其一致表达模式支持进一步研究。与之一致，MSL组织中被描述有 AKT/ERK 相关级联的上调或激活。MSL发病机制需要与临床相似实体进行明确分子区分。脂肪瘤常与12q13-15重排、HMGA2过表达或融合相关，其生长受包膜限制，与MSL不同；这里 hASCs 显示持续分化能力，观察到更高细胞密度，部分病例 resazurin 信号更高，不符合 HMGA2 驱动的肿瘤模型。脂肪水肿证据提示微血管病、毛细血管渗漏和炎症信号（如 TNF-α、IL-6、VEGF相关轴）在发病中起关键作用，但关于 mTOR 信号作用报告不一致。淋巴水肿（VEGFR3/FLT4相关）中，原发性淋巴功能障碍被认为导致后续 TGF-β 介导的纤维化和继发性脂肪组织肥大。这些模式提示MSL中基底膜重塑和向生存与增殖信号的旁分泌转变。尽管具有假设性和初步性，考虑到层粘连蛋白轴（LAMC1、LAMA4）、COL4A1和MFGE8的发现，以及 HDGF、MYDGF和S100A7上调，该观点尤其合理。Santella et al. 的最新多组学研究提示进行性脂肪水肿中 AKT1 介导的重塑，而 Cifarelli et al. 将经典脂肪水肿描述为促炎巨噬细胞浸润和致密间质纤维化。无论如何，研究人员的观察既非典型淋巴水肿，也非脂肪水肿或肿瘤驱动的脂肪瘤。在分子水平，这一发现可由多种 ECM 相关蛋白支持，这些蛋白在 FDR 校正前具有不同谱。除 LAMC1 显著发现外，分泌组结果提示基底膜成分层粘连蛋白β1（LAMB1，p = 0.059）、IV型胶原（COL4A1，p = 0.066）和集聚蛋白（AGRN，p = 0.062）呈细微但一致下调，尽管统计效力低。这些成分通过调节 FAK、PI3K/AKT 和 MAPK/ERK 通路直接影响增殖和细胞存活。其他生长因子如 HDGF 和 MYDGF 强调 PI3K/AKT 和 ERK 依赖性生存信号激活的可能性。FST 被报道调节 TGF-β/Activin 轴，因此可能负责分化和扩增之间的不匹配。微环境参与至少由 Top 20 列表中 CSF1、S100A7 和补体因子 C3 的存在提示。尽管其可能与局部巨噬细胞及 NF-κB 或 ERK 依赖性信号相互作用，但并未完全表达原发性炎症性脂肪病典型模式。同时，研究人员观察到MSL分泌组中分泌型细胞外超氧化物歧化酶（SOD3）名义显著下调；连同钙网蛋白（CALR）上调，这提示可能存在氧化应激或内质网应激。考虑到MSL患者中曾描述线粒体改变，促增殖调节背后的氧化还原敏感机制似乎合理。总之，初步结果符合一个假设性MSL模型：细胞类型特异性改变诱导微环境和ECM局部重塑。与上述部分具有可识别驱动因素的相似实体相反，MSL传播可能通过无明显主驱动因素的促增殖信号发生。另一个相关评论是酒精关联。文献中MSL常与慢性酒精滥用及相应共病和病史相关。除既往关于MSL线粒体参与的报告外，酒精也可能促进线粒体应激和代谢失衡，这两种机制均是MSL讨论主题。此外，滥用酒精据报与肝脏ECM重塑相关，而ECM变化可影响全身或局部脂肪祖细胞。尽管本研究未直接评估，其作用应在未来研究中检查。与ECM重塑假说一致，基于MMP（如 qPCR 中 MMP1）的结果在生物学上合理，因为MMP参与并部分控制ECM动态、细胞迁移和分化龛。这些发现为未来功能读出或抑制实验提供基础。线粒体改变已在家族亚组中描述，但并非普遍存在。同时，有证据支持基因组模式以及向 CK2/AKT/ERK 轴的信号激活。因此，MSL可能被视为综合征而非单一疾病实体，尤其从临床角度及其异质性病因来看。研究局限包括：小样本量是MSL这类孤儿病固有的，限制统计效力；因此校正多重假设检验后无单个蛋白或基因通过 FDR 0.05，分子发现为探索性和假设生成。此外，仍存在因临床相似性与其他脂肪瘤样实体混淆的风险，例如 Dercum 病仍是诊断不确定性的可能来源；另一方面，临床诊断由一位资深医师（L.P.）进行以减少观察者间变异。另一局限是仅使用一种针对代谢还原活性的功能读出和一种 wt-hASCs 细胞系，未来研究应包括 EdU/BrdU 掺入等正交增殖试验。最后，根据机构标准方案，仅使用 GAPDH 作为参考基因；根据 MIQE 指南，此种情况需要验证其表达稳定性，但本研究未进行。此外，多位作者报告了人 ASCs qPCR 中可与 GAPDH 一起使用的替代参考基因，例如真核翻译延伸因子1α1（EEF1A1）。尽管有这些局限，研究人员的研究仍代表迄今MSL中首个且最大的个体内分泌组分析。需要更大多中心研究验证探索性结果，这些结果提示多发性对称性脂肪瘤病中脂肪源性干细胞主要呈细胞内在失调。研究人员的功能、蛋白质组和转录读出为活化的增殖相关信号和细胞外基质改变提供了新假设。

研究结论翻译：总之，趋同模式与细胞外基质重塑及 PI3K/AKT-ERK 相关增殖信号一致。该模型支持 MSL 中祖细胞水平失调而非单一克隆驱动因素的假说，但仍需在更大队列中进行进一步机制验证。研究人员的功能、蛋白质组和转录读出为多发性对称性脂肪瘤病中活化的增殖相关信号和细胞外基质改变提供了新假设。