《Scientific Reports》：Technical validation and feasibility of video particle tracking for low-volume measurement of biliary micro-viscosity after liver transplantation
编辑推荐：
摘要专业翻译
人体胆汁生物物理性质的可靠量化需要经过分析验证的方法和标准化的分析前条件。研究人员假设，在肝移植（LTx）后的人体胆汁中，胆汁微黏度可以在预定义的分析性能（准确度：与参考值的偏差≤15%；重复性：变异系数CV<10%）下被量化。在这项方法开
摘要专业翻译
人体胆汁生物物理性质的可靠量化需要经过分析验证的方法和标准化的分析前条件。研究人员假设，在肝移植（LTx）后的人体胆汁中，胆汁微黏度可以在预定义的分析性能（准确度：与参考值的偏差≤15%；重复性：变异系数CV<10%）下被量化。在这项方法开发与技术验证研究中，研究人员建立了一种在LTx后人体胆汁中量化微黏度的方法。使用蔗糖标准品进行验证，结果显示高准确度（与参考值的偏差≤15%）、强线性相关性（R2=0.996）以及良好的重复性（CV<10%）。该方法被应用于从9例患者纵向收集的21份LTx后胆汁样本。平均微黏度在术后第1天为1.58±0.54 mPa·s，第7天为1.94±0.63 mPa·s，第14天为1.44±0.16 mPa·s。分析前的冷冻和冷却引入了测量变异性，支持在采集后尽快进行分析。这些发现证明了基于视频粒子追踪的胆汁微黏度测量在LTx后具有分析性能和实际可行性。未来需要结合标准化新鲜样本工作流程、胆汁生化表征和纵向临床结局数据的更大规模研究，以确定胆汁微黏度的生物学相关性及其对未来移植物建模的潜在价值。
论文解读文章
一、研究背景与问题
对于急性或慢性终末期肝病患者而言，肝移植（LTx）仍是唯一的根治性治疗手段。鉴于供体器官持续短缺，边缘性移植物（marginal grafts）的评估与利用已成为移植决策中的关键环节。拒绝边缘器官可能增加等待名单上患者的死亡风险，而接受预先损伤的移植物则可能增加早期移植物功能障碍、胆道并发症或术后器官衰竭的风险。
预测LTx后患者特异性结局需要能够整合肝脏生理与病理多尺度复杂性的计算工具。目前已开发出肝小叶的连续介质-生物力学、多相和多尺度耦合模型，用于模拟组织结构、肝内灌注和细胞代谢之间的相互作用。然而，这类模型的参数化和验证需要覆盖肝脏跨尺度结构、功能和血流动力学特性的实验与临床数据集。尽管血窦网络的血流动力学建模已相对成熟，但肝内胆汁流动的计算建模仍发展不足。定量胆汁黏度数据是未来对胆道运输进行物理一致性建模的前提条件，但目前在移植后早期阶段尚缺乏此类数据。特别是胆道黏度等本构参数——这些参数是构建物理一致的胆汁运输模型中流动阻力所必需的——尚未在LTx背景下得到表征。
胆汁由肝细胞通过分泌离子、脂质、胆汁盐及其他成分进入胆小管（bile canaliculi）而产生。长期以来，胆小管内胆汁运输被认为由渗透压驱动，但近期体内成像实验挑战了这一观点：虽然平流仍主导胆管中的胆汁流动，但胆小管内的胆汁运输现在被认为以扩散为主。胆汁的流变学特性，尤其是黏度，与肝脏内胆汁的生理流动相关。移植后胆汁产生被认为是移植物功能的早期指标，胆汁成分和黏度的改变与胆汁淤积和胆结石形成等病理状态相关。
传统上，宏观流变学方法（如毛细管黏度测定法）被用于表征生物流体，但此类方法提供的是体相黏度测量，无法解析局部流变异质性。相比之下，微流变学技术已越来越多地应用于血液、血浆、人类黏液和眼液等多种生物流体，其优势在于所需样本量极小，且能够探测与体相行为不同的局部黏弹性特性。然而，与其他生物流体相比，人体胆汁的系统性黏度测量仍然有限，且通常局限于小规模队列，尤其是缺乏在胆结石疾病、胆汁淤积或其他明显胆道病理之外获得的临床特征明确的胆汁样本。目前尚缺乏LTx后胆道黏度的相关研究。
基于上述背景，研究人员在本研究中建立并验证了一种基于视频粒子追踪（VPT）的方法，用于系统测定LTx后患者的胆汁微黏度。该方法能够以低样本量表征与肝内胆汁流动相关的本构参数，并为未来将胆道运输特性整合入患者特异性移植物建模提供概念验证数据。
二、研究设计与方法
本研究为前瞻性方法开发与技术验证研究，纳入莱比锡大学医院9例接受原位肝移植的成人患者，排除标准为高紧急移植和肝移植禁忌证，所有移植物均来自脑死亡（DBD）供体。胆汁样本通过经吻合口Neuhaus胆道引流导管，在术后第1、7和14天通过无菌抽吸采集，采集后立即以2500 g离心10分钟以减少细胞和上皮碎片。研究经莱比锡大学医学中心伦理委员会批准（编号063/25），并在德国临床试验注册中心注册（DRKS00039499）。
研究采用的主要关键技术方法包括：其一，视频粒子追踪微流变学（VPT-micro-rheology）方法，即向样本中加入荧光羧基化聚苯乙烯乳胶微球（直径0.5 μm，最终浓度1:5000 v/v），在自制测量腔室（高度约120 μm）中通过倒置荧光显微镜（Zeiss Observer Z1，40×物镜，总放大倍数400×）以12.5帧/秒的帧率记录30秒粒子布朗运动，随后使用Fiji软件的TrackMate插件进行粒子检测与轨迹重建，并通过自定义Matlab脚本计算均方位移（MSD）和扩散系数，最终经斯托克斯-爱因斯坦方程（Stokes-Einstein equation）计算动态黏度。其二，使用五种浓度（0%、10%、20%、30%、40% w/v）的蔗糖标准溶液进行方法验证，评估准确度（与文献参考值的偏差）和重复性（变异系数CV）。其三，分析前条件系统评估，包括冷冻-解冻循环（?30°C储存后室温解冻）、短期冷藏（5°C储存24和48小时）以及离心过滤（3000 g，1小时，3 kDa截留分子量）对测量结果的影响。
三、研究结果
验证测量（Validation of the measurement setup）
在蔗糖参考溶液中的验证测量表明，示踪粒子的均方位移（MSD）在前5秒延迟时间内呈线性依赖关系，表明纯扩散运动且无黏附或流动伪影。每种溶液独立制备10份样本并重复测量，变异系数（CV）总体低于10%，显示高测量稳定性和重复性。两种计算方法均与参考值吻合良好：方法1显示强线性相关（斜率=1.16 mPa·s/mPa·s，截距=?0.22 mPa·s，R2=0.996），方法2相关性相似（斜率=1.08 mPa·s/mPa·s，截距=?0.32 mPa·s，R2=0.997）。Bland-Altman分析显示，方法1的平均偏倚为0.186 mPa·s，所有测量均落在预定义的±15%接受限内；方法2的平均偏倚为?0.119 mPa·s，但有两个测量值超出±15%接受限。鉴于方法1总体CV略低（5.83% vs. 6.17%）且与参考值吻合更好，后续分析均采用方法1。每次测量过滤后保留超过150条粒子轨迹，确保MSD分析的稳健性。
胆汁微黏度测量（Micro-viscosity of bile samples）
将VPT方法应用于来自9例LTx患者的21份人体胆汁样本，均获得技术上可评估的黏度测量结果，样本内CV值总体低于15%。由于部分患者样本量有限，术后第1、7、14天分别分析了6、8和7份样本。Kruskal-Wallis检验显示三个术后时间点之间无统计学显著差异（p=0.218）。平均微黏度（均值±标准差）在术后第1天为1.58±0.54 mPa·s（CV=34.5%），第7天为1.94±0.63 mPa·s（CV=32.3%），第14天为1.44±0.16 mPa·s（CV=11.1%）。术后第1天和第7天较高的变异系数表明样本间存在显著变异性，而第14天变异性明显降低。
分析前条件及其影响（Pre-analytics and influence on measurement）
冷冻-解冻条件（N=10）： 将新鲜测量等分样本（采集后1小时内分析，37°C维持）与?30°C储存后解冻的匹配等分样本进行比较。10份样本中有3份在解冻后黏度显著降低，超过新鲜对应样本的15%，最大降幅达39.2%；5份样本保持相对稳定，变化低于10%。冷冻-解冻后平均相对变化为?8.27%±14.85%，95%置信区间为?18.89%至2.35%。尽管配对比较未达到统计学显著性（Wilcoxon符号秩检验，V=12，p=0.13），但多个个体样本的偏差超过了预定义的±15%接受阈值，且置信区间下限跨越该阈值。因此，冷冻-解冻循环可能引入超过预定义分析接受阈值的测量变异性，应尽可能避免。
生理温度和冷藏温度下的短期储存（N=6）： 将新鲜等分样本与5°C储存24小时和48小时的匹配等分样本进行比较。6份样本中有5份在冷藏储存后仅显示微小变化，但1份样本在48小时后较新鲜测量值增加了近40%，导致平均相对变化为9.6%±14.8%，置信区间较宽（?5.9%至25.2%）。Friedman检验显示新鲜、24小时和48小时储存等分样本之间无统计学显著差异（卡方=4.0，p=0.135），Kendall's W指示中等效应量（W=0.33），提示存在未达统计学显著性的潜在趋势。短期冷藏总体稳定但个别样本产生显著偏差，因此冷藏储存尚不能视为与新鲜测量等效。
离心和过滤（N=5）： 对5份胆汁样本进行离心过滤（3000 g，1小时，3 kDa截留分子量），所得滤液和截留液的黏度与相应天然样本进行比较，详细结果见补充信息。
四、讨论与结论
本研究建立了一种基于视频粒子追踪的胆汁微黏度测定方法，并系统评估了分析前处理的影响。该方法表现出高重复性，CV总体低于15%，在参考样本和胆汁样本范围内提供稳定测量，支持该方法适用于胆汁等小体积、异质性生物流体。
胆汁色素本身不干扰基于荧光的示踪粒子检测，仅在严重血液污染的术中胆汁样本中观察到粒子可见性降低。术后胆汁样本均经离心处理以减少颗粒污染，因此报告值主要反映去除较大细胞和上皮碎片后的处理胆汁的微流变学特性，而非未处理天然胆汁中粗颗粒物质的贡献。残留的亚细胞颗粒、黏蛋白或蛋白质聚集体、脂质结构、炎症成分和其他大分子组分仍可能影响示踪粒子迁移率，其具体贡献有待未来结合微流变学与胆汁生化和显微表征的研究阐明。
分析前研究表明，样本应尽可能在采集后立即处理以最小化处理相关变化。该工作流程周转时间约1.5小时，适合常规实验室实施。观察到的样本处理效应可能反映冷却、冷冻和解冻过程中胆汁成分局部组织的变化，包括胆汁盐胶束、脂质囊泡、黏蛋白或蛋白质聚集体、水合状态和残余颗粒物质的变化，但这一解释仍属假设性。
与现有流变学方法相比，VPT具有样本需求极小、可直接观察布朗运动、能检测宏观技术无法触及的局部微异质性等优势。微流变学测量在示踪粒子位移尺度上探测局部流体阻力，可为未来胆道运输多尺度模型提供互补的尺度特异性信息。然而，当前离体测量未再现胆小管的几何结构或受限环境，不应被解释为胆小管流变环境的直接测量。
本研究作为技术验证和可行性评估，纳入的患者和胆汁样本数量相对较少，尚不足以评估生物学变异性、临床参考范围或与移植物功能和术后结局的关联。胆汁样本的生化组成也未进行分析。未来研究应结合生化表征、互补的宏观流变学测量和更大规模的临床队列，以进一步探索胆汁微黏度的生物学和潜在临床相关性。
综上所述，研究人员建立了一种经分析验证且可重复的基于VPT的胆汁微黏度测量方法，适用于小体积人体胆汁样本。该研究证明了该方法在临床环境中的技术可行性，为未来研究胆汁微流变学的生化决定因素和潜在临床相关性提供了方法学基础。
