整合转录组学与蛋白质组学揭示香港牡蛎与熊本牡蛎氨基酸组成及蛋白表达谱差异

《Foods》：Integrated Transcriptomics and Proteomics Reveal Amino Acid Composition and Protein Expression Profiles of Crassostrea hongkongensis and Crassostrea ariakensis

　　

摘要专业翻译 香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）与熊本牡蛎（Crassostrea ariakensis）是具有重要商业价值和营养价值的牡蛎品种。然而，二者在氨基酸组成和蛋白表达谱方面的物种特异性差异及其潜在机制仍知之甚少。本研究整合高效液相色谱（HPLC）、转录组学及蛋白质组学分析以解决上述问题。熊本牡蛎的总水解氨基酸含量显著高于香港牡蛎，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸为两个物种中的主要氨基酸。蛋白质组学分析鉴定出1371个差异表达蛋白（DEPs），主要富集于蛋白酶体、剪接体、核糖体及氨基酸代谢通路。转录组学分析筛选出16747个差异表达基因（DEGs），显著富集于Notch信号通路、泛素介导的蛋白水解、神经活性配体-受体相互作用及吞噬体通路。蛋白质组学与转录组学的整合分析共同鉴定出5条共有KEGG通路，其中基因集富集分析（GSEA）显示，细胞外基质（ECM）-受体相互作用和叶酸生物合成通路在香港牡蛎中显著下调，提示其可能参与塑造氨基酸组成和蛋白丰度差异。综上，这些发现为进一步研究物种特异性营养差异及其对牡蛎养殖的潜在意义奠定了基础。

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一、研究背景与科学问题

牡蛎是全球经济价值最高、养殖范围最广的双壳类软体动物之一，在渔业和水产养殖中占有重要地位。牡蛎富含氨基酸、蛋白质、多糖和维生素等营养物质，深受消费者青睐。在中国，香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）和熊本牡蛎（Crassostrea ariakensis）是巨蛎属（Crassostrea）内亲缘关系密切的两个物种，广泛养殖于南方沿海和河口地区。尽管二者形态相似，但在栖息地偏好、生长速度和胁迫耐受性方面存在明显差异：熊本牡蛎通常栖息于低盐度、浑浊的河口环境，而香港牡蛎更适应相对高盐度的沿海水域且生长更快。

牡蛎肉的营养价值主要取决于其蛋白质含量和氨基酸组成。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，可直接影响海产品的风味特征。例如，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸等游离氨基酸是决定牡蛎鲜味和甜味的主要成分。已有研究表明，不同牡蛎物种间的氨基酸组成存在显著差异，且环境因素也会调节氨基酸含量。然而，在可比环境条件下，香港牡蛎与熊本牡蛎之间氨基酸组成和蛋白表达谱的物种特异性差异及其潜在分子机制仍 largely 未知。

近年来，转录组学和蛋白质组学等多组学技术已被广泛用于揭示双壳类动物适应性及营养品质调控的分子机制。然而，尚无研究将基于HPLC的氨基酸谱分析与转录组学和蛋白质组学分析整合，在相同环境条件下系统比较香港牡蛎与熊本牡蛎。本研究正是针对这一研究空白，旨在通过多组学整合策略，将氨基酸组成与潜在分子调控机制直接关联，从而更全面地理解物种特异性营养差异。

二、研究内容与主要发现

研究人员提出三个假设：（i）熊本牡蛎与香港牡蛎会呈现不同的氨基酸谱，尤其在风味相关氨基酸方面；（ii）这些差异伴随蛋白质合成、降解和代谢相关基因及蛋白的物种特异性表达模式；（iii）转录组与蛋白质组整合分析将揭示连接分子调控与营养性状的关键通路。

研究结果显示，熊本牡蛎的总水解氨基酸含量及各单一氨基酸含量均显著高于香港牡蛎，其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸为主要氨基酸。甘氨酸和丙氨酸共同决定海产品的甜味，谷氨酸是海产品鲜味的主要来源，脯氨酸与胶原蛋白的柔韧性和凝胶质地密切相关，丝氨酸则参与海产品蛋白质的代谢转化并影响新鲜度。这些差异可能影响消费者偏好以及各物种在不同烹饪方式（生食、烹饪或加工）中的适用性。

三、关键技术方法

本研究采用三种核心技术手段：一是高效液相色谱（HPLC）技术测定总水解氨基酸组成，采用钠型阳离子交换柱和茚三酮柱后衍生化检测；二是转录组测序（RNA-seq），基于Illumina Novaseq^TM 6000平台进行2×150 bp双端测序，经Trinity软件进行de novo组装，以edgeR进行差异表达分析；三是基于DIA（数据非依赖采集）模式的蛋白质组学分析，采用Thermo Astral质谱仪，以DIA-NN软件进行无文库分析，蛋白序列搜索数据库为UniProtCrassostrea gigas参考蛋白质组（UP000005408）。样本采集自中国广东省湛江市北部湾（21°41′ N，108°48′ E），时间为2025年8月，每个物种采集6个个体，每种分析使用3个生物学重复，每个生物学重复来源于单个个体，未进行样本混合。

四、研究结果

3.1 氨基酸组成分析

通过HPLC分析发现，熊本牡蛎的总水解氨基酸含量及各氨基酸含量均显著高于香港牡蛎。甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸是两个物种中的主要氨基酸，这一结果与既往研究一致。

3.2 蛋白质组学分析

共鉴定出4871个蛋白质和23728条肽段。PCA分析显示两物种样本清晰分离，PC1解释47.35%的方差。火山图分析显示，在香港牡蛎与熊本牡蛎的比较中，分别有641个和730个蛋白质显著上调和下调。GO富集分析表明差异表达蛋白（DEPs）显著富集于苏氨酸型内肽酶活性、蛋白酶体核心复合物、U1 snRNP和胞质大核糖体亚基等过程。KEGG富集结果显示DEPs显著参与蛋白酶体、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解、剪接体、核糖体及其他氨基酸代谢相关通路。蛋白酶体降解蛋白质可释放游离氨基酸和短肽，可能影响组织中游离氨基酸的组成和含量，从而影响风味，这可能与两物种间甘氨酸和丙氨酸等风味氨基酸的差异有关。

3.3 转录组测序与de novo组装**

经质量过滤后，香港牡蛎获得5.64 Gb干净碱基，熊本牡蛎获得5.57 Gb。de novo组装共获得65542条unigenes，并利用NR、GO、KEGG、Pfam、SwissProt和eggNOG数据库进行功能注释。以FDR < 0.05且FC > 2为标准，共鉴定出16747个差异表达基因（DEGs），其中7788个上调和8959个下调。PCA分析显示两组样本显著分离，PC1解释97.46%的方差。

3.4 DEGs的GO和KEGG富集分析

GO富集分析显示DEGs显著富集于钙离子结合、ADP-核糖二磷酸酶活性、核酸酶活性、蛋白酪氨酸磷酸酶活性等分子功能，以及质膜和质膜整合组分等细胞组分，还涉及Toll样受体信号通路、阳离子跨膜转运、DNA整合等生物学过程。KEGG富集分析表明DEGs显著富集于Notch信号通路、昆虫激素生物合成、泛素介导的蛋白水解、神经活性配体-受体相互作用、吞噬体等通路。Toll样受体是先天免疫系统中重要的模式识别受体，双壳类依赖先天免疫防御各种微生物入侵。泛素化可调控蛋白质降解、转运和信号转导，对蛋白质稳态、DNA修复、细胞周期调控和免疫应答至关重要。Notch信号通路在调节免疫细胞活化与浸润、细胞增殖和骨骼肌发育中发挥重要作用。

3.5 转录组与蛋白质组关联分析

Venn分析显示，蛋白质组学的40条通路和转录组学的31条通路中有5条共有通路：ECM-受体相互作用、半乳糖代谢、叶酸生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢以及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。其中ECM-受体相互作用通路最为显著，包含44个DEGs。值得注意的是，多个DEGs与其对应DEPs的表达趋势相反。例如，在ECM-受体相互作用通路中，COL3A1、COL2A1、COL22A1和COL6A4等基因的转录水平在香港牡蛎中显著上调，但其蛋白表达水平却显著降低。这种不一致性提示这些基因可能受到转录后或翻译后调控，包括miRNA介导的翻译抑制、蛋白质稳定性改变或蛋白酶体降解增强。

3.6 基于共有KEGG通路的基因集富集分析（GSEA）

GSEA分析显示，ECM-受体相互作用（ES = ?0.46，|NES| = 1.51，NOM p-值 < 0.05）和叶酸生物合成（ES = ?0.69，|NES| = 1.90，FDR = 0.005）在香港牡蛎中相对于熊本牡蛎显著下调。氨基糖和核苷酸糖代谢与UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）的合成直接相关，后者是几丁质和糖蛋白合成的必要前体。ECM组分（如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白）及其受体在贝壳形成、肌肉附着和免疫应答中发挥关键作用。叶酸（维生素B9）是单碳代谢过程的辅因子，对核苷酸合成、DNA甲基化和氨基酸稳态至关重要。

五、讨论总结与研究结论

本研究通过整合HPLC、转录组学和蛋白质组学分析，系统比较了香港牡蛎与熊本牡蛎的氨基酸组成和蛋白表达谱差异。研究结果表明，熊本牡蛎的总氨基酸含量及各单一氨基酸含量均高于香港牡蛎，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸为主要氨基酸。蛋白质组学（1371个DEPs）与转录组学（16747个DEGs）的整合分析共同鉴定出5条共有KEGG通路：ECM-受体相互作用、半乳糖代谢、叶酸生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢以及AGE-RAGE信号通路。其中，GSEA进一步表明ECM-受体相互作用和叶酸生物合成通路在香港牡蛎中显著下调。这些共有通路涉及细胞外基质/碳水化合物代谢和应激信号传导，与蛋白质稳态和肌肉功能的研究结果一致。这些分子差异可能有助于解释观察到的营养性状差异，尽管本研究未进行直接的表型测量。总体而言，这些发现为理解牡蛎氨基酸组成和蛋白表达谱物种特异性差异的分子基础提供了更清晰的认识，为进一步研究营养差异及其对牡蛎养殖的潜在意义奠定了基础。