吡咯里西啶生物碱在茶与草本浸饮中的LC-MS/MS测定方法开发与验证

《Foods》：Determination of Pyrrolizidine Alkaloids in Tea and Herbal Infusions by LC-MS/MS

　　

吡咯里西啶生物碱（Pyrrolizidine alkaloids, PAs）及其N-氧化物（PANOs）是受监管限值约束的食品安全危害物，其在茶与草本浸饮（teas and herbal infusions, THI）中的存在构成一条膳食暴露途径。本研究旨在开发并验证一种液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）方法，用于测定THI中五种PAs及其相应PANOs。样品采用热酸化水提取以增强PAs和PANOs的萃取效率，并经过固相萃取（solid-phase extraction, SPE）进行净化与分析物富集。色谱分离在Luna? PFP (2) 3 μm 100 ?色谱柱上进行，采用含0.1%甲酸的10 mM甲酸铵水溶液、乙醇和甲醇组成的梯度流动相。该方法依据国际指南完成验证，检出限和定量限分别为0.41–6.60 ng/g和1.25–20.0 ng/g。研究人员将该方法应用于来自五个欧洲国家的53份THI样品，主要来自葡萄牙，作为试点监测研究。N-氧化物为主要存在形式，其中千里光宁-N-氧化物（senecionine-N-oxide）、天芥菜碱-N-氧化物（heliotrine-N-oxide）和倒千里光碱-N-氧化物（retrorsine-N-oxide）在葡萄牙市售产品中检出频率最高。草本浸饮中目标PAs/PANOs总含量约为茶类的两倍，其中洋甘菊含量最高，其次为柠檬马鞭草。经验证的方法为THI中PAs和PANOs的初步评估提供了灵敏且适用的工具。

吡咯里西啶生物碱在茶与草本浸饮中的污染风险与检测方法研究解读

一、研究背景与意义

吡咯里西啶生物碱（Pyrrolizidine alkaloids, PAs）及其N-氧化物衍生物（PANOs）是主要由菊科（Asteraceae）、紫草科（Boraginaceae）和豆科（Fabaceae）植物产生的次生代谢产物。目前已鉴定的PAs超过660种，结构多样性显著。其中，1,2-不饱和型PAs因可被代谢激活为具有肝毒性、基因毒性和致癌性的活性吡咯代谢物，被认为毒理学意义最为重大。欧洲食品安全局（EFSA）和德国联邦风险评估研究所（BfR）已将1,2-不饱和型PAs及其PANOs列为食品监测和风险评估的优先污染物。EFSA确立了237 μg/kg体重/天的基准剂量下限置信限（BMDL₁₀），而BfR则推荐更为保守的每日最大摄入限值0.007 μg/kg体重/天，凸显了当前的不确定性及建立可靠发生数据的需求。

人类暴露于PAs的主要途径是摄入受污染的食物和饮料，其中茶与草本浸饮（teas and herbal infusions, THI）因其消费广泛且频繁，被认为是慢性膳食暴露的主要来源。PAs可能通过有意使用产PA植物、收获期间与产PA杂草共采、加工过程交叉污染、掺假或植物学误鉴等途径进入THI。鉴于PAs的毒理学潜力和THI的普遍消费，建立灵敏可靠的分析方法以监测THI中PAs和PANOs的发生情况，对支持风险管理决策和保障公众健康具有重要意义。然而，食品和草本基质的复杂性以及目标化合物通常存在的痕量浓度，要求高效的样品前处理程序以减少基质干扰并实现准确定量。现有方法在分析物覆盖范围、样品制备、验证策略和分析性能方面存在差异，亟需开发兼具广泛分析物测定、高效样品制备和准确量化能力的方法。

二、主要技术方法

研究人员开发并验证了一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的测定方法。样品采用热酸化水（85 °C，pH 3，硫酸调节）提取15分钟，经玻璃微纤维滤膜过滤后，使用Oasis^? MCX混合模式阳离子交换固相萃取（SPE）小柱进行净化和富集，以5%氨乙醇溶液洗脱。色谱分离采用Luna^? PFP (2) 3 μm 100 ?色谱柱（150 × 4.60 mm），流动相为含0.1%甲酸的10 mM甲酸铵水溶液（A）与乙醇-甲醇混合液（30:20，v/v）（B）的梯度体系，流速0.4 mL/min，总运行时间42分钟。质谱检测采用电喷雾离子源正离子模式（[M+H]⁺），通过多反应监测（MRM）模式监测每个化合物的两个离子对，分别作为定量离子和定性离子。内标采用(+)-LyN-d₇（(+)-lycopsamine-N-oxide-d₇）。方法依据ICH指南及SANTE 11312/2021 v2指南进行验证。研究样本包括来自葡萄牙（26份）、西班牙（11份）、法国（9份）、奥地利（4份）和意大利（3份）共53份市售THI样品，其中52份为袋装，1份为散装。

三、研究结果

3.1 初步试验与色谱优化

研究人员首先在LC-UV/Vis系统上优化色谱条件，虽实现了所有目标分析物的基线分离，但灵敏度不足以检测复杂基质中的痕量水平，因此将方法转移至LC-MS/MS。经优化后，天芥菜碱（Ht）和倒千里光碱-N-氧化物（RtN）虽共流出，但凭借不同的前体离子及定量/定性离子可实现明确鉴定。离子比偏差采用比SANTE指南（±30%）更保守的±20%标准。

3.2 样品前处理程序优化

研究人员比较了QuEChERS和SPE两种样品前处理方法。三种QuEChERS方案均因富集能力不足，无法达到痕量定量所需的检出限，导致绝对回收率不佳。相比之下，SPE方法采用MCX小柱，因其对碱性分析物的高选择性和高效去除酸性及极性基质组分的能力而被选用。通过逐步优化确定最佳条件为：2.00 g样品、250 mL酸化水提取、MCX净化。较大的样品量增加了提取的分析物数量，提高了灵敏度而不损害净化能力；250 mL提取体积更接近实际冲泡一杯茶或草本浸饮的用水量，反映了真实消费条件。酸化水-乙醇混合提取溶剂因提取效率降低及上样过程中分析物损失而表现较差。

3.3 方法验证

方法验证依据ICH指南完成。选择性通过空白提取物中目标分析物和内标保留时间处无干扰峰得以确认。线性方面，大部分化合物的相关系数（R²）大于0.99，仅McN为0.9666，但该化合物的准确度和精密度令人满意。日内精密度为1.43%–8.17%，日间精密度为5.72%–18.40%。准确度大多为83.5%–111%，HtN和Sc分别为70.6%和137%，虽超出常规接受标准，但与其他已发表的THI中PAs LC-MS/MS方法报道的范围一致，反映了复杂食品基质中基质组成、提取效率和基质诱导电离效应的差异。基质效应（ME）评估显示，十种分析物中七种呈现不同程度的信号抑制，三种呈现信号增强，但基质匹配校准曲线有效校正了这些影响。定量限（LOQ）为1.25–20.0 ng/g，检出限（LOD）为0.41–6.60 ng/g，与文献报道的水平相当。

3.4 方法应用

研究人员将验证后的方法应用于53份THI样品的分析。结果显示，单猪屎豆碱（Mc）在所有样品中均未检出，其N-氧化物（McN）仅在一个样品中检出且低于LOQ。天芥菜碱（Ht）和天芥菜碱-N-氧化物（HtN）分别在6个和7个样品中检出，其中仅两个样品含可定量水平的HtN，一个样品含量达32.4 ng/g。倒千里光碱（Lc）仅在一个样品中定量为1.26 ng/g。检出频率最高的化合物为千里光宁-N-氧化物（ScN），在11个样品中检出。N-氧化物形式为主要存在形态，ScN、RtN和HtN为最常检出的化合物，这一模式与欧洲其他调查结果一致，通常归因于收获期间Senecio属植物的交叉污染。在53份样品中，18份检出目标PAs/PANOs，其中11份含量高于LOQ。草本浸饮的检出频率和总含量高于传统茶类，总目标PAs/PANOs含量约为茶类的两倍。洋甘菊检出频率最高，约33%的阳性样品为洋甘菊，含量最高达68.8 ng/g；柠檬马鞭草也呈现显著水平（58.5 ng/g和34.1 ng/g）。传统茶类（绿茶、红茶、白茶）含量较低，范围为1.65–42.1 ng/g，其中葡萄牙市场购买的一份红茶（PT026）含量最高。

四、讨论与结论

研究结果与文献报道的总体趋势一致，但整体污染水平较低，反映了地理来源、植物组成、收获季节和农艺或加工实践的差异。研究人员指出，各国间的检出频率和浓度差异应谨慎解读，可能反映植物组成、原料来源或生产实践的差异，也可能受各国样品数量有限且不均衡的影响。此外，购买国并不一定对应原料的地理来源。该数据集不足以评估葡萄牙人群的特定膳食暴露，因此未进行膳食暴露评估。研究结论指出，本研究开发并验证了一种灵敏、选择性的LC-MS/MS方法，适用于THI中目标PAs和PANOs的测定。在53份分析的THI样品中，18份检出目标PAs/PANOs，以N-氧化物形式为主，草本浸饮尤其是洋甘菊和柠檬马鞭草的检出频率较高。尽管浓度总体较低，但在人群经常消费的产品中检出具有已知肝毒性和基因毒性潜力的化合物，凸显了进一步调查其发生情况和膳食暴露贡献的重要性。这些发现为五个欧洲国家（主要为葡萄牙）市售部分THI中目标PAs和PANOs的发生情况提供了初步数据，该地区现有的发生数据仍然有限，需要更多证据以支持更稳健的风险表征。