运动与高脂饮食小鼠骨骼肌自噬-溶酶体相关标记物及Nrf2/ARF1信号通路的关系

《Nutrients》：Exercise Is Associated with Skeletal Muscle Autophagy–Lysosome-Related Markers and Nrf2/ARF1 Signaling in HFD Mice

　　

目的：本研究旨在探究运动对长期高脂饮食（HFD）诱导的骨骼肌功能障碍的保护作用及其潜在机制，重点关注ADP-核糖基化因子1（ARF1）相关自噬-溶酶体标记物和核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路。方法：将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常饮食组（DC）和高脂饮食组，后者在12周高脂喂养后进一步分为模型组（MG）、运动组（EG）、Nrf2抑制剂组（NG）和运动联合Nrf2抑制剂组（ENG）。EG接受6周中等强度跑台运动，NG给予Nrf2抑制剂6周，ENG同时接受6周跑台运动和抑制剂注射。检测血清脂质、血糖和胰岛素抵抗指数；采用H&E染色观察骨骼肌形态；通过RT-qPCR、Western blotting和免疫组织化学检测ARF1、ULK1、ATP6V0A1等因子的mRNA和蛋白表达；采用ELISA检测氧化应激指标；通过免疫荧光分析ARF1/ATP6V0A1与溶酶体标记物Lamp1的共定位。结果：长期HFD显著增加小鼠体重、血清TC、TG、LDL-C、FBG水平和HOMA-IR指数，诱导骨骼肌形态改变（肌纤维排列疏松、细胞内大量空泡），抑制ARF1、ULK1和ATP6V0A1的mRNA表达，并升高丙二醛（MDA）含量（p < 0.05或p < 0.01）。6周中等强度跑台运动有效改善HFD诱导的代谢紊乱和骨骼肌形态损伤，上调ARF1、ULK1和ATP6V0A1的表达，并降低氧化应激（p < 0.05或p < 0.01）。值得注意的是，木犀草素介导的Nrf2信号抑制可能部分逆转运动诱导的ARF1相关自噬-溶酶体标记物和骨骼肌形态的改变。结论：长期HFD可诱导骨骼肌形态改变，伴随ARF1相关自噬-溶酶体标记物变化和氧化应激升高；相反，中等强度运动可能通过Nrf2信号通路改善HFD相关的骨骼肌形态变化，为针对HFD诱导的代谢相关骨骼肌功能障碍的运动干预策略提供潜在的分子靶点和理论基础。

**运动与高脂饮食小鼠骨骼肌自噬-溶酶体相关标记物及Nrf2/ARF1信号通路的关系——论文解读**

**1. 研究背景与问题**

长期高脂饮食（high-fat diet, HFD）是肥胖、代谢紊乱、心血管疾病及多种恶性肿瘤患病率上升的主要驱动因素。当骨骼肌遭受HFD刺激引起的代谢紊乱时，氧化应激和炎症状态趋于加重，进而促进肌肉质量丢失。自噬是维持细胞内细胞器质量控制与代谢稳态的关键分解代谢过程，其功能紊乱与骨骼肌代谢性疾病密切相关。自噬性溶酶体再生（autophagic lysosome reformation, ALR）作为自噬的关键下游环节，通过从自噬溶酶体膜再生功能性溶酶体来维持自噬流的持续进行，对骨骼肌正常自噬活性和细胞稳态不可或缺。ADP-核糖基化因子1（ADP-ribosylation factor 1, ARF1）是一种小Ras家族GTP酶，作为调控细胞内膜运输和脂质代谢的关键分子开关，参与溶酶体膜融合、调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）活性，影响溶酶体降解效率和脂质代谢。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）是重要的抗氧化转录因子，在应激条件下激活下游抗氧化和抗炎基因转录。运动已被证实可通过调节氧化应激和自噬对HFD诱导的骨骼肌代谢损伤发挥保护作用。然而，Nrf2介导的抗氧化信号是否与ARF1及自噬相关标记物的改变相互作用，从而介导HFD应激下运动诱导的骨骼肌保护效应，此前尚未阐明。本研究旨在探讨运动与HFD诱导的骨骼肌分子及形态学改变、ARF1和自噬相关标记物变化之间的联系，并验证运动与Nrf2和ARF1相关自噬-溶酶体标记物改变相关的假说。

**2. 研究内容与主要结论**

研究人员使用40只7周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为正常饮食组（DC组，n=8）和高脂饮食组（HFD组，n=32）。HFD组经12周高脂喂养后，进一步分为模型组（MG）、运动组（EG）、Nrf2抑制剂组（NG）和运动联合Nrf2抑制剂组（ENG），每组8只。EG接受6周中等强度跑台运动（0°坡度，12 m/min，每天60 min，每周5天），NG腹腔注射Nrf2抑制剂木犀草素（20 mg/kg，每周5次，共6周），ENG同时接受运动与抑制剂注射。动物处理和样本采集过程中研究人员对分组信息设盲。实验方案经长江大学动物实验伦理委员会批准（批准号202401025，日期2024年7月10日）。

研究发现：长期HFD显著增加小鼠体重、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）和胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），诱导骨骼肌形态学改变（肌纤维排列疏松、大量细胞内空泡、肌组织面积比例降低），抑制骨骼肌中Arf1、Atp6v0a1和Ulk1的mRNA表达，升高丙二醛（MDA）和乳酸脱氢酶A（LDH-A）水平，降低乳酸脱氢酶B（LDH-B）表达。6周中等强度跑台运动显著改善HFD诱导的代谢紊乱和骨骼肌形态损伤，上调Arf1、Atp6v0a1、Ldh-b和Ulk1的mRNA及ULK1蛋白表达，增强ARF1和ATP6V0A1与溶酶体标记物Lamp1的共定位，降低LDH-A表达和氧化应激水平。使用Nrf2抑制剂木犀草素后，运动对ARF1相关自噬-溶酶体标记物的上调作用部分被逆转，骨骼肌形态改善效应也受到削弱。结论认为，长期HFD可诱导骨骼肌形态改变，伴随ARF1相关自噬-溶酶体标记物变化和氧化应激升高；中等强度运动可能通过Nrf2信号通路改善HFD相关的骨骼肌形态变化，为HFD诱导的代谢相关骨骼肌功能障碍的运动干预策略提供潜在分子靶点和理论基础。

**3. 关键实验方法**

本研究采用动物实验设计，小鼠来自中国三峡大学动物研究中心，饲养于长江大学动物中心。主要技术方法包括：（1）中等强度跑台运动干预和腹腔注射Nrf2抑制剂木犀草素；（2）生化指标检测：采用微板法检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C，ELISA检测空腹胰岛素（FINS），计算HOMA-IR；（3）苏木精-伊红（H&E）染色观察骨骼肌形态并定量肌组织面积比例；（4）荧光免疫组织化学染色检测ARF1、ATP6V0A1与Lamp1的表达及共定位，计算Pearson和Manders相关系数；（5）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测mRNA表达；（6）Western blotting检测蛋白表达；（7）ELISA检测MDA、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和L-乳酸脱氢酶（L-LDH）等氧化应激指标；（8）统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD事后检验。

**4. 研究结果**

**4.1 长期高脂饮食可诱导骨骼肌一系列损伤**
通过比较DC组和HFD组体重变化，发现HFD组在12周内体重显著高于DC组（p < 0.05或p < 0.01）。MG组血清TC、TG、LDL-C、FBG、FINS和HOMA-IR均显著高于DC组（p < 0.01）。H&E染色显示DC组肌细胞形态完整、排列紧密，而MG组肌细胞排列疏松、大量细胞内空泡、肌组织面积比例显著降低（p < 0.01），表明长期HFD诱导了骨骼肌分子和形态学改变。

**4.2 HFD与骨骼肌中ARF1相关自噬-溶酶体标记物的变化相关**
RT-qPCR结果显示，与DC组相比，MG组骨骼肌中Arf1、Atp6v0a1、Ulk1和Ldh-b的mRNA表达显著降低（p < 0.05或p < 0.01），而Ldh-a mRNA表达显著升高（p < 0.05或p < 0.01）。免疫荧光双染显示，MG组骨骼肌溶酶体中ARF1和ATP6V0A1表达降低，与Lamp1的共定位减弱。ELISA显示MG组MDA水平显著升高（p < 0.05），Western blot显示LDH-A蛋白表达显著增加（p < 0.01或p < 0.05）。这些结果表明HFD诱导的氧化应激与ARF1相关自噬-溶酶体标记物改变相关。

**4.3 运动与长期HFD喂养小鼠骨骼肌中ARF1相关自噬-溶酶体标记物的变化相关**
运动干预后，EG组自第5周起体重显著低于MG组（p < 0.01），且TC、TG、LDL-C、FBG、FINS和HOMA-IR水平均显著降低（p < 0.01）。H&E染色显示EG组肌纤维间间隙变窄、细胞内空泡减少、肌组织面积比例显著增加（p < 0.01）。运动显著上调Arf1、Atp6v0a1、Ldh-b和Ulk1的mRNA表达（p < 0.05或p < 0.01），降低Ldh-a mRNA表达（p < 0.05或p < 0.01）。免疫荧光显示EG组ARF1和ATP6V0A1在溶酶体中的表达及与Lamp1的共定位显著增强。ELISA显示EG组L-LDH水平显著上升，ENG组GPx和MDA含量较MG组显著降低；Western blot显示EG组Nrf2、ULK1和LDH-B蛋白表达显著升高，LDH-A表达降低。表明运动与HFD小鼠骨骼肌形态改善及ARF1相关自噬-溶酶体标记物的改变相关联。

**4.4 ARF1相关自噬-溶酶体标记物与Nrf2信号通路的关联**
使用Nrf2抑制剂木犀草素后，NG组肌细胞排列疏松、组织形态不规则、细胞内空泡增多，肌组织面积减少；ENG组肌细胞排列较规则、空泡减少、肌组织面积增加。与EG组相比，NG组Arf1、Atp6v0a1、Ldh-b和Ulk1的mRNA表达显著降低（p < 0.05或p < 0.01），Ldh-a mRNA表达显著升高（p < 0.01）；ENG组Ulk1 mRNA水平较NG组显著降低（p < 0.05或p < 0.01），而Arf1 mRNA表达较NG组显著升高（p < 0.01）。NG组ARF1表达降低，ATP6V0A1表达略升高；ENG组两者均中度升高。ELISA显示NG组L-LDH水平较EG组显著降低（p < 0.05）。Western blot显示NG组Nrf2蛋白表达较EG组显著降低（p < 0.01或p < 0.05）；ENG组较NG组Nrf2、ATP6V0A1、LDH-A、LDH-B和ULK1蛋白表达均显著降低（p < 0.01或p < 0.05）。这些结果表明Nrf2信号与ARF1相关自噬-溶酶体标记物的变化相关联。

**5. 讨论与结论总结**

讨论部分指出，溶酶体不仅是细胞废物处理区室，更是营养感知和信号转导的中枢代谢枢纽。HFD暴露通过脂毒性、线粒体功能障碍和氧化应激导致骨骼肌质量减少、胰岛素敏感性降低和运动能力受损，而自噬过程中溶酶体重塑缺陷是核心机制之一。mTORC1通路在细胞代谢调控中起关键作用，ARF1通过传递营养感知信号参与mTORC1的溶酶体转位，ARF1的乳酰化修饰可能调控ALR和线粒体转运。研究发现HFD小鼠骨骼肌中Arf1、Atp6v0a1和Ulk1的mRNA表达显著降低，但蛋白水平无显著差异，可能源于转录-翻译解偶联或蛋白质稳态缓冲机制。HFD还导致LDH-A异常上调、LDH-B表达受抑，促使有氧糖酵解转向无氧糖酵解，引起乳酸积累、活性氧（ROS）产生增加和脂质过氧化，伴随MDA升高，并通过Nrf2/ARE途径补偿性上调GPx。Nrf2与mTORC1存在双向串扰，运动作为一种可控的氧化应激可激活Nrf2信号，增强骨骼肌抗氧化能力。运动还能通过AMPK、CaMK、SIRT1等信号激活自噬，并通过乳酸诱导的mTOR乳酰化抑制mTORC1活性，启动自噬。本研究中运动上调Arf1和Atp6v0a1的mRNA以及LDH-B和ULK1的表达，增强ARF1和ATP6V0A1与Lamp1的共定位，下调LDH-A表达，表明运动与减弱氧化应激和改变自噬相关标记物相关联。

研究的局限性包括：未深入探究Nrf2调控ARF1的特异性转录结合位点；实验设计缺乏正常饮食+木犀草素组和正常饮食+运动组；木犀草素作为药理性Nrf2调节剂缺乏严格选择性；仅揭示Nrf2与ARF1的相关性而未验证因果调控方向；未检测ARF1的直接乳酰化修饰；未进行直接的自噬流和溶酶体再生检测；未测量骨骼肌功能指标如收缩功能、握力和抗疲劳能力。

结论：长期HFD可诱导骨骼肌形态改变，伴随ARF1相关自噬-溶酶体标记物变化和氧化应激升高；中等强度运动与自噬体-溶酶体相互作用及ARF1定位相关标记物的改变相关联，同时减少HFD暴露骨骼肌中脂滴积累。总之，运动与HFD小鼠骨骼肌自噬-溶酶体相关标记物及Nrf2/ARF1信号通路相关。