阿尔伯蒂埃希菌CdtB对嗜热四膜虫CU427的细胞毒性机制：捕食者-猎物相互作用的新视角

《Microorganisms》：A Prey–Bacterivore Interaction: CdtB Involvement in the Cytotoxicity Mechanism of Escherichia albertii Against Tetrahymena thermophila CU427

　　

专业摘要翻译 阿尔伯蒂埃希菌（Escherichia albertii）是一种革兰氏阴性、兼性厌氧杆菌，被认定为一种人畜共患食源性病原体。水生环境中的E. albertii种群可能与原生动物宿主共存。致病菌与其原生动物捕食者之间的动态相互作用可能超越共享生长空间，并涉及宿主定向的细胞毒性。E. albertii携带与细胞毒性相关的基因，如cdt、stx和astA。本研究旨在阐明cdtB在E. albertii与嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）CU427菌株相互作用中的作用。细胞致死膨胀毒素（CDTs）是由三个亚基组成的蛋白质外毒素；CdtB需要CdtA和CdtC结合到鞘糖脂神经节苷脂GM1和GM3上，才能在哺乳动物细胞中诱导完全的细胞毒性。本研究发现神经节苷脂GM1在CU427中高度分布，而GM3则无类似分布，这表明神经节苷脂GM1可能在四膜虫细胞中作为CdtB的受体。然而，霍乱毒素B亚基处理未能抑制E. albertii对CU427的细胞毒性。研究人员采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯/碘化丙啶染色的活/死细胞检测法，对感染了表达重组E. albertii CdtB的大肠杆菌的CU427进行了评估。结果显示，CU427的活细胞数量在24小时后减少了一半，其趋势与E. albertii感染相似。这些结果表明，CdtB参与了E. albertii对原生动物宿主（尤其是四膜虫）的细胞毒性作用，并提示其细胞毒性机制，特别是与宿主细胞的相互作用，不同于在哺乳动物细胞中的机制。因此，本研究为深入理解CdtB在E. albertii细胞毒性机制中的作用提供了新的见解。

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一、研究背景与目的

阿尔伯蒂埃希菌（Escherichia albertii）是一种新近被认识的人畜共患食源性病原体，可引起人类胃肠炎，尤其在婴幼儿中较为常见。该菌存在于水环境中，因此很可能与水生的原生动物宿主共存。原生动物是细菌的重要捕食者，它们之间的相互作用不仅限于食物链关系，还可能包括病原菌对宿主的定向细胞毒性，这种复杂的互作关系对于理解病原菌在水环境中的存活、传播以及人畜共患病的预防具有重要意义。然而，目前关于E. albertii如何与原生动物建立或控制捕食者-猎物关系的分子机制尚不清楚。已知E. albertii携带多种毒力因子，如细胞致死膨胀毒素（Cytolethal Distending Toxin, CDT）、志贺毒素（Shiga toxin, Stx）和耐热肠毒素1（EAST-1）。其中，CDT是一种由CdtA、CdtB和CdtC三个亚基组成的三聚体蛋白外毒素，CdtB具有DNase I活性，是主要的毒性亚基。在哺乳动物细胞中，CdtB需要CdtA和CdtC的帮助才能与细胞膜上的神经节苷脂GM1和GM3结合并发挥完全毒性。本研究旨在探究cdtB基因在E. albertii与嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）CU427菌株相互作用中的具体角色，以揭示其细胞毒性机制及其与哺乳动物细胞中的差异。

二、主要技术方法

1. 1.
   感染实验筛选：研究人员使用不同感染复数（Multiplicity of Infection, MOI 10、100、1000）将E. albertii分别感染草履虫（Paramecium caudatum）和嗜热四膜虫（T. thermophila），在48小时通过显微镜计数形态和运动正常的活细胞，以评估细胞毒性。以大肠杆菌DH5α作为对照。
2. 2.
   基因表达分析：通过聚合酶链式反应（PCR）筛查E. albertii中存在的细胞毒性相关基因。随后，利用实时定量PCR（qRT-PCR）检测cdtB和astA基因在不同培养温度（25°C、30°C、37°C）下的相对表达水平，并以16S rRNA基因作为内参。
3. 3.
   神经节苷脂分布与抑制实验：使用荧光标记的霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit, CTxB）和抗GM3抗体，通过免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微镜观察神经节苷脂GM1和GM3在草履虫和四膜虫细胞表面的分布。随后，通过向感染体系中加入不同浓度的CTxB或抗GM3抗体进行抑制实验，评估其对E. albertii细胞毒性的影响。
4. 4.
   重组蛋白表达与细胞毒性验证：将E. albertii的cdtB基因克隆至pCold载体，并在大肠杆菌DH5α中诱导表达重组CdtB蛋白。随后，将表达重组CdtB的大肠杆菌（E. coli pCold_cdtB）、空载体对照（E. coli pCold）以及野生型E. albertii分别与四膜虫CU427共培养。采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯/碘化丙啶（CFSE/PI）双染色的活/死细胞检测法，在共培养后0.5小时和24小时，通过显微镜观察和计数活细胞比例。

三、研究结果

3.1 感染实验筛选

初始筛选发现，E. albertii对草履虫没有表现出细胞毒性，草履虫的细胞数量甚至随着细菌投喂量的增加而增加，表明E. albertii像普通细菌一样被当作食物消化了。相反，E. albertii对四膜虫表现出显著的细胞毒性：在MOI为100时，四膜虫活细胞数显著减少；在MOI为1000时，导致细胞完全死亡。这揭示了两种亲缘关系很近的原生动物对同一细菌截然不同的敏感性。

3.2 毒力相关基因分析

PCR筛查显示，本研究所用的E. albertii菌株携带cdtB、stx2f和astA三种毒力基因。更重要的是，qRT-PCR分析发现，astA和cdtB基因在模拟原生动物宿主生存环境的较低温度下（25°C和30°C）的表达量均高于37°C。特别是cdtB，其在30°C（即四膜虫的培养条件）下的表达量较37°C时增加了约40倍。这一显著的温度依赖性上调表达强烈暗示cdtB可能在E. albertii对四膜虫的毒性中扮演关键角色。

3.3 神经节苷脂GM1和GM3的分布与抑制实验

免疫荧光染色结果显示，神经节苷脂GM1在四膜虫细胞表面有强烈的特异性分布，但在草履虫细胞表面未检测到。而神经节苷脂GM3在两种原生动物细胞表面均未观察到特异性信号。基于此，研究人员假设GM1可能是CdtB在四膜虫上的受体。然而，抑制实验的结果出乎意料：无论是单独使用CTxB（竞争性结合GM1）还是抗GM3抗体，或是两者联合使用，均未能有效阻止E. albertii对四膜虫的杀伤作用。这表明，尽管GM1在四膜虫上高表达，但它并非介导E. albertii CdtB细胞毒性的功能性受体。

3.4 重组CdtB的细胞毒性验证

为了直接证明CdtB的作用，研究人员构建了仅表达E. albertii CdtB的重组大肠杆菌。实验结果显示，感染了表达重组CdtB的大肠杆菌的四膜虫，其活细胞数量在24小时后也减少了约一半，这与感染野生型E. albertii的效果非常相似。而感染空载体对照大肠杆菌的四膜虫细胞数量则略有增加。CFSE/PI双染色的活/死细胞检测进一步证实了这一结果：在24小时，感染E. albertii和重组CdtB菌株的四膜虫中，大量细胞呈现强PI信号（死细胞）或异常圆形形态，活细胞比例降至约50%。这一结果有力地证明了CdtB本身足以介导对四膜虫的细胞毒性，且这种作用不依赖于完整的CDT全毒素复合物。

四、讨论与结论

本研究首次揭示了E. albertii对嗜热四膜虫的特异性细胞毒性，并明确了CdtB在此过程中的关键作用。研究表明，E. albertii与四膜虫的关系并非简单的捕食与被捕食，而是病原菌主动杀死捕食者的“反向”攻击。这种机制可能有助于E. albertii逃避原生动物捕食，从而在水环境中存活和传播。

研究的一个核心发现是，CdtB对四膜虫的毒性机制与在哺乳动物细胞中已知的机制存在显著差异。在哺乳动物细胞中，CdtB必须与CdtA、CdtC协同，并结合细胞膜上的神经节苷脂GM1/GM3才能发挥作用。然而，在本研究中：

1. 1.
   尽管四膜虫细胞表面富含GM1，但阻断GM1并不能抑制毒性。
2. 2.
   四膜虫表面缺乏可检测的GM3。
3. 3.
   仅表达CdtB亚基的大肠杆菌就能有效杀死四膜虫。

这些证据共同指向一个全新的假说：在四膜虫中，CdtB可能通过一种不依赖CdtA/CdtC和经典神经节苷脂受体的途径进入细胞并发挥毒性。研究人员推测，四膜虫吞噬细菌后，CdtB可能在吞噬泡内被释放，并通过作用于吞噬泡膜上一个尚未被鉴定的、四膜虫特有的受体来启动细胞死亡程序。

研究结论总结：虽然E. albertii与肠道致病性大肠杆菌性质相似，但其在嗜热四膜虫体内的命运却截然不同。本研究的发现表明，E. albertii编码的CdtB参与了针对嗜热四膜虫的细胞毒性，并且这种毒性不需要结合GM1或GM3。所观察到的E. albertii细胞毒性表明，E. albertii利用四膜虫作为自然宿主或载体的能力有限。尽管细菌或宿主菌株及相互作用条件可能影响这一现象，限制了广泛的普适性，但这些发现暗示了水生环境中独特且多样的原生动物-细菌关系。本研究首次为E. albertii的CdtB毒素特性及其对嗜热四膜虫活力的影响提供了更深入的见解。CdtB可能通过与神经节苷脂GM1和GM3之外的受体结合，在不依赖CdtA和CdtC介导的早期附着的情况下，触发嗜热四膜虫的细胞毒性，诱导细胞损伤。