《Animals》：Effects of Long-Term Salinity Exposure on Growth, Survival, Hepatopancreatic Health, and Intestinal Microbiota in Juvenile Chinese Mitten Crabs (Eriocheir japonica sinensis)
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盐度是甲壳类水产养殖中的关键环境因子，但其对中华绒螯蟹（Eriocheir japonica sinensis）幼蟹的长期影响仍知之甚少。研究人员将大眼幼体（megalopae）在0、15和30 ppt下饲养7个月，每个处理设3个重复缸。评估了生长、存活、肝胰
盐度是甲壳类水产养殖中的关键环境因子，但其对中华绒螯蟹（Eriocheir japonica sinensis）幼蟹的长期影响仍知之甚少。研究人员将大眼幼体（megalopae）在0、15和30 ppt下饲养7个月，每个处理设3个重复缸。评估了生长、存活、肝胰腺（hepatopancreas）组织学与生物化学、多组学（multi-omics）图谱以及肠道细菌群落。0 ppt组蟹取得最大生长和产量。15 ppt组存活率最高，但生长和产量最低；30 ppt组存活率最低，尽管幸存个体生长优于15 ppt组。盐度升高与更明显的肝胰腺病变和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）阳性信号、血清转氨酶活性升高及白蛋白降低相关。盐水条件下免疫相关酶活性升高，而抗氧化能力下降、脂质过氧化增加。多组学分析突出溶酶体（Lysosome）和酪氨酸代谢（Tyrosine metabolism）通路。肠道细菌多样性随盐度升高呈增加趋势，伴随弧菌属（Vibrio）相对丰度升高和Dysgonomonas丰度降低。因此，15 ppt有利于存活但不支持生长，而30 ppt与最差组织状况和最低存活相关。这些发现表明，在评估长期养殖盐度适宜性时，应综合考虑存活、生长、产量和生理健康。
盐度是影响水生动物，尤其是广盐性甲壳类存活、生长和生理状态的重要环境因子。十足目甲壳类在盐度波动下需进行渗透和离子平衡调节，并付出能量代价以调整渗透压调节、代谢、抗氧化防御和先天免疫；若这些需求持续存在，氧化还原平衡可能紊乱，活性氧积累，导致细胞损伤和组织功能受损。盐度还可通过影响环境微生物和宿主肠道环境而塑造肠道细菌群落。然而，急性暴露下的响应未必能预测长期养殖中的生理驯化、累积损伤或生产权衡。对中华绒螯蟹幼蟹而言，在较长养殖周期中维持不同盐度是否会在生长、存活、肝胰腺状况和肠道细菌群落间产生一致或分化响应仍不清楚，这一知识缺口限制了仅凭存活或生长评价长期养殖盐度适宜性的可靠性。中华绒螯蟹是经济重要性溯河洄游甲壳类，成体自淡水迁至半咸水或海水繁殖，幼体随后迁入淡水生长；长江口水域盐度约0至30 ppt，早期生活史可能经历明显盐度变化。肝胰腺参与消化、营养储存、代谢、解毒和免疫相关功能，其结构和功能完整性是健康的重要指标；非特异性免疫常用酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和溶菌酶（LZM）评价，抗氧化状态可用超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和总抗氧化能力（T-AOC）及脂质过氧化指标丙二醛（MDA）表征。自噬和凋亡在环境应激细胞响应中作用不同，AMPK连接能量状态与自噬调节，FoxO可偶联氧化还原信号与自噬相关基因转录。肠道细菌群落则提供盐度影响的互补视角，其组成影响营养利用、上皮功能和免疫调节，并易受环境条件影响。基于此，研究人员评估长期盐度对中华绒螯蟹幼蟹性能和健康的影响，目标包括比较生长、存活和产量；确定这些性能差异是否伴随肝胰腺结构、生化状况和分子通路变化；表征肠道细菌群落变化并判断其是否与动物性能和肝胰腺状况差异一致。研究假设生长和存活在不同盐度下响应不同，并伴随肝胰腺状况和肠道细菌群落组成变化。该研究将生长、存活与肝胰腺损伤、肠道细菌群落结构结合评价，有助于区分幼蟹在某一盐度下的存活能力与该盐度对长期养殖的整体适宜性。
关键技术方法方面，实验大眼幼体来源于中国江苏省盐城Jinyang Aquatic Germplasm Resources Field，在室内水产设施（E 120°38′，N 33°50′）自5月15日至12月15日饲养。九个水泥池随机分为0、15和30 ppt三组，每组3池，每池放40 g大眼幼体，约6154只，养殖7个月。研究人员采用生长、存活和产量计算，肝胰腺苏木精-伊红（H&E）染色和TUNEL检测，血清与肝胰腺生化指标测定，肝胰腺RNA-seq转录组、LC-MS非靶向代谢组、16S rRNA V3–V4肠道菌群测序，以及qRT-PCR验证和转录组-代谢组整合分析，并以独立水泥池为实验单元进行统计。
研究结果如下。3.1 长期盐度暴露对生长和存活的影响：通过7个月养殖比较，0 ppt组最终体长、体宽、体高、体重、增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和总产量最高，30 ppt组居中，15 ppt组最低；存活率则以15 ppt组最高，其次为0 ppt组，30 ppt组最低。生长相关指标与存活呈现相反的盐度依赖模式，30 ppt组幸存个体生长优于15 ppt组，但存活率更低。3.2 盐度相关肝胰腺损伤与凋亡信号：组织学显示，0 ppt组肝胰腺小管结构相对完整，15 ppt组出现管腔扩大、上皮空泡化、基膜部分脱离和局部上皮细胞脱落，30 ppt组则出现严重小管紊乱、广泛细胞质空泡化、明显上皮脱落和基膜破坏；TUNEL染色中0 ppt组阳性信号少，15和30 ppt组阳性信号更广泛，30 ppt组最强。3.3 对长期盐度暴露的生化响应：血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性随盐度升高而增加，白蛋白（Alb）和肝胰腺总蛋白（TP）下降；SOD、CAT和T-AOC随盐度升高而下降，GSH-Px和MDA升高；ACP和AKP在15和30 ppt组高于0 ppt组，LZM在15 ppt最高、30 ppt次之、0 ppt最低；脂肪酶（LPS）、胰蛋白酶、胃蛋白酶和淀粉酶（AMS）活性在0 ppt最高，30 ppt居中，15 ppt最低。3.4 肝胰腺转录组响应：RNA-seq获得57.73 Gb clean data，主成分分析显示盐度处理间分离；0 ppt vs 15 ppt、0 ppt vs 30 ppt、15 ppt vs 30 ppt分别鉴定1019、1097和1095个差异表达基因（DEGs），共有94个共享DEGs；KEGG富集显示溶酶体和酪氨酸代谢通路在三个比较中均被识别，GSEA显示溶酶体通路在0 ppt vs 15 ppt中上调，在涉及30 ppt的比较中呈下调趋势，酪氨酸代谢在所有比较中一致下调，qRT-PCR验证与RNA-seq一致。3.5 肝胰腺代谢组响应：LC-QTOF非靶向代谢组共检测4649种代谢物，正离子模式2665种，负离子模式1984种；差异积累代谢物（DAMs）在三个比较中广泛存在，1974种DAMs为共享；KEGG差异丰度评分显示，0 ppt vs 15 ppt中映射到AMPK和FoxO信号通路的DAMs主要增加，涉及30 ppt的比较中轴突再生相关DAMs主要增加，表明长期盐度暴露伴随肝胰腺广泛代谢重塑。3.6 整合转录组和代谢组：双向正交偏最小二乘分析显示基因和代谢物对联合模型贡献，相关分析整合|r|>0.8且p<0.05的DEGs-DAMs对；联合KEGG分析中，溶酶体和酪氨酸代谢通路作为长期盐度暴露整合响应的重要候选通路，且每个通路均映射有DEGs和DAMs。3.7 盐度相关肠道细菌群落谱变化：16S rRNA基因扩增子测序共获得1,163,850条双端reads，质控后保留1,068,797条clean reads，平均每样本71,253条；所有样本鉴定2219个操作分类单元（OTUs），25个OTUs为三组共享；ACE和Chao1指数在30 ppt高于0 ppt，Shannon和Simpson指数随盐度升高趋于增加；PCoA和NMDS显示三组细菌群落分离；优势门包括Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidota和Fusobacteriota，优势科包括Mycoplasmataceae、Vibrionaceae、Erysipelotrichaceae和Dysgonomonadaceae，属水平上Candidatus Bacilloplasma、Vibrio、ZOR0006和Dysgonomonas较丰富；高盐组Candidatus Bacilloplasma和Vibrio相对丰度较高，ZOR0006和Dysgonomonas较低；冗余分析中盐度向量与Vibrio和Malaciobacter同向，与Dysgonomonas反向；LEfSe提示Vibrio和Vibrionaceae区分30 ppt，Mycoplasmatales区分15 ppt，Dysgonomonas和Alphaproteobacteria区分0 ppt。总体而言，肠道细菌群落随盐度变化，高盐条件下Vibrio相对丰度升高、Dysgonomonas降低。
讨论部分总结：研究人员认为，0 ppt组最终体尺、WGR、SGR和总产量最高，符合中华绒螯蟹幼蟹淡水生长阶段特征；两种盐水处理均降低生长和产量，消化酶活性下降提示消化能力降低可能参与生长受限，但酶活性不能直接等同摄食或营养同化。30 ppt幸存者较大且消化酶活性高于15 ppt，但30 ppt存活率最低，这种恢复可能反映能量需求增加下的补偿响应，也可能受幸存密度降低或高盐耐受个体选择性存活影响，不能解释为该盐度对群体有利。15 ppt存活最高但生长和产量最低，维持渗透平衡等生理功能可能减少用于体生长的能量。肝胰腺方面，血清ALT和AST升高、Alb和TP下降与组织损伤后细胞内酶泄漏和蛋白相关生化状态改变一致；组织学病变和TUNEL阳性信号随盐度增加，30 ppt最严重，说明长期盐水养殖损害肝胰腺状况，且30 ppt组未像部分生长和消化酶指标那样恢复。氧化还原方面，SOD、CAT和T-AOC随盐度增加而下降，MDA升高，提示抗氧化能力降低和脂质过氧化增加，并与膜完整性、线粒体功能受损及凋亡信号增强相关。免疫方面，ACP和AKP在盐水组升高，LZM在15 ppt最高，可能与溶酶体加工和非特异性抗菌防御补偿有关，但这些酶活性不能单独解释存活模式或证明整体免疫增强。转录组和代谢组显示营养储存、脂质分配、AMPK/FoxO信号、脂肪酸合成和CoA依赖代谢等变化；整合分析突出溶酶体和酪氨酸代谢，酪氨酸代谢随盐度升高呈负富集，溶酶体通路在15 ppt正富集而在涉及30 ppt时负富集，提示15 ppt下细胞维持和回收响应可能有助于存活，但未阻止生长下降；30 ppt下该维持响应未能持续，并与更严重损伤和死亡相关。肠道菌群方面，盐度显著改变细菌群落，多样性随盐度增加而升高，但未对应更好动物性能；Candidatus Bacilloplasma在盐水组增加，Dysgonomonas降低，后者曾被认为与植物性饲料消化有关，其减少可能降低复杂碳水化合物利用的微生物贡献；Alphaproteobacteria在0 ppt富集；Vibrio随盐度升高而增加，30 ppt最高，可能构成额外健康风险。综合模型表明，长期盐度暴露伴随消化能力、氧化还原平衡、肝胰腺状况、先天免疫相关酶、溶酶体/自噬相关通路和肠道细菌群落结构的 coordinated 变化。应用上，淡水在所测条件中最适合幼蟹长期养殖，15 ppt的存活优势不能补偿生长和产量下降；若必须使用盐水，应评估0至15 ppt中间盐度、逐步盐度调整和维持消化能力与能量供应的营养策略，并筛选可维持生长和存活且肝胰腺损伤有限的耐盐家系；MDA、SOD、CAT、T-AOC及血清ALT和AST可作为候选生化指标组合，ACP、AKP、LZM和GSH-Px因响应补偿或非线性，不宜单独使用。局限方面，生化、转录组、代谢组和qRT-PCR基于每处理三个独立池级混合生物学重复，重复数有限，组织混合也限制个体水平变异评估；肠道菌群五个跨池复合样本虽来自非重叠蟹组，但每个复合样本包含三个池材料，池身份未保留，因此微生物结果代表处理相关模式而非五个独立池级响应。
结论翻译：长期养殖盐度对中华绒螯蟹幼蟹性能和健康产生不同影响。在本实验条件下，0 ppt组蟹表现出最大生长和总产量，且肝胰腺改变最不明显，表明在所测盐度中总体养殖结果最好。尽管15 ppt导致最高存活率，但也产生最低个体生长和总产量，因此该处理代表存活-生长权衡，而非长期生产的普遍有利条件。30 ppt组存活率最低，并表现出最明显的肝胰腺病变、TUNEL阳性信号、脂质过氧化以及总体抗氧化能力下降。转录组和代谢组分析将溶酶体和酪氨酸代谢鉴定为显著的盐度响应通路。盐度还与肠道细菌群落谱变化相关，随着盐度增加，Vibrio相对丰度趋于升高，Dysgonomonas趋于降低。总体上，当综合考虑生长、产量和组织状况时，两种盐水处理均未优于淡水。这些发现表明，评估中华绒螯蟹幼蟹长期养殖盐度制度适宜性时，应使用存活、生长、产量和健康相关指标，而非仅依据存活。
