《Advances in Sample Preparation》：Nasal exudate sampling for GFAP determination: A comparative study of collection devices and recovery methods for point-of-care stroke diagnosis
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脑-鼻引流通过筛板经类淋巴清除通路（glymphatic clearance pathway）的发现，为神经系统疾病的生物标志物诊断开辟了新可能性。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）是早期鉴别出血性与
脑-鼻引流通过筛板经类淋巴清除通路（glymphatic clearance pathway）的发现，为神经系统疾病的生物标志物诊断开辟了新可能性。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）是早期鉴别出血性与缺血性卒中的临床相关生物标志物，然而其在鼻分泌物（nasal exudate, NE）中丰度极低，构成显著的分析挑战。现有鼻采样装置及处理流程通常针对传染性呼吸道疾病设计，其分析物浓度显著更高。本研究评估了三种NE采集装置（植绒尼龙拭子、GrooveSwab?和Nasosorption?拭子）及多种回收方案在从NE中回收GFAP的有效性。植绒尼龙拭子在蛋白回收率和患者舒适度方面表现优异，是GFAP测定的最优选择。相比之下，尽管GrooveSwab?和Nasosorption?拭子的蛋白回收率较低，但在分析物浓度较高或替代诊断格式的应用中展现出潜力。结合涡旋与离心的回收方案提供了最高的GFAP释放效率且损失最小。总体而言，这些发现支持分散化NE采样用于GFAP测定的可行性，并凸显其整合入卒中诊断的快速、微创即时检测工作流程的潜力。
论文解读
一、研究背景与问题
在神经病学领域，快速准确的诊断对于获得及时、经济高效且分散化的信息以指导早期临床决策和改善患者预后至关重要。这在卒中情况下尤为关键，因为诊断及卒中类型（缺血性vs.出血性）分类的延迟直接影响发病率和死亡率。目前，卒中诊断仍主要依赖临床标准和神经影像学技术，如磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）或正电子发射断层扫描（PET）。虽然移动卒中单元（MSUs）有潜力使这些技术分散化，但其成本高昂且需要专业人员。因此，基于生物标志物的诊断将代表神经系统疾病（如卒中）管理的重大进步。尽管已鉴定出众多卒中诊断生物标志物，其在临床实践中的整合仍然有限。
在提出的卒中诊断生物标志物中，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）已成为症状发作后数小时内区分出血性与缺血性卒中最有前景的候选标志物之一。GFAP是星形胶质细胞蛋白，在脑内出血后释放到生物体液中，其在血液和脑脊液（CSF）中的早期升高已被广泛报道。由于紧急卒中护理需要可在无专门基础设施条件下快速部署的诊断工具，GFAP构成评估旨在分散化卒中分诊的替代采样策略的合适模型中枢神经系统（CNS）生物标志物。
当研究CNS来源的生物标志物时，血脑屏障（BBB）的存在限制了众多CNS来源蛋白向外周血的转移。因此，生物标志物主要通过腰椎穿刺获取的CSF进行研究，这是一种高度侵入性的操作。然而，近期进展聚焦于通过鼻分泌物（NE）收集CNS信息，因为嗅觉区域通过筛板与大脑邻近，其多孔性使得脑类淋巴系统的液体能够排入鼻腔。这一脑清除通路已在动物和人类模型中广泛研究，提供了从解剖学上比常规外周样本来源更接近CNS的区域获取脑相关信息的非侵入性方法。例如，阿尔茨海默病患者的鼻分泌物中检测到β-淀粉样蛋白，而缺血性和脑内出血卒中患者的鼻分泌物中发现铁、GFAP、铁蛋白和膜铁转运蛋白（ferroportin）的差异水平。
传统上，鼻腔液体采样方法聚焦于呼吸道感染诊断，大多数采集装置和方案均为此目的开发。COVID-19大流行催生了众多新型鼻采样装置，但其回收低丰度蛋白（如GFAP）的适用性仍未得到充分表征。在鼻采样领域，拭子类装置仍是最广泛使用的工具，其主要在杆材料、采集尖端材料（纤维素类如棉，或合成类如尼龙）以及采集材料的构型（尖端几何形状和附着方式）三方面存在差异。
二、研究内容与主要结论
本研究对三种商用NE采集装置——植绒尼龙拭子、GrooveSwab?和Nasosorption?——在从模拟和真实NE样本中回收GFAP（作为模型CNS生物标志物）方面的效能进行了评估。研究比较了不同的样本处理工作流程，评估了体积和蛋白回收率，并讨论了装置设计和操作对分析性能的影响。研究目的是确定哪些采样策略最适合从NE中回收低丰度蛋白，重点关注其在快速、微创卒中鉴别诊断中的潜在应用。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要技术方法：扫描电子显微镜（SEM）成像用于表征三种采集装置的形态和物理特性；基于分光光度检测的商品化抗体对免疫测定法（ELISA）用于定量GFAP浓度；重力法用于计算体积回收率；模拟样本（含已知GFAP浓度的PBS/BSA缓冲液）和真实临床样本（来自10名健康志愿者和4名卒中患者）结合使用；五种样本处理方案（手动混合、涡旋混合、涡旋加离心、无缓冲液离心、无缓冲液免冷冻离心）的比较评估。样本来源包括HUCA卒中单元的连续卒中患者（症状发作48小时内）和健康志愿者，研究经阿斯图里亚斯公国伦理委员会批准（批准号198/16）。
四、研究结果
鼻分泌物采集装置的比较
SEM成像揭示了三种装置直接影响液体摄取和释放的独特结构特征。吸收能力测试显示，植绒尼龙拭子在模拟与真实样本之间存在显著差异（约50 mg，p = 1.2·10–7），Nasosorption?拭子呈现类似趋势（约30 mg，p = 2.4·10–4），而GrooveSwab?显示最小变异（约3 mg，p = 0.1）。这些差异与装置尺寸和采集机制一致：GrooveSwab?依靠表面张力的薄盘结构在少量样本下即饱和，而毛细驱动的装置理论上可吸收比真实NE样本通常获得的更大体积。真实NE样本采集质量的变异性高（RSD大），强调了标准化程序的重要性，包括采样前后称重装置以准确确定吸收的样本质量。用户舒适度评估中，植绒尼龙拭子被100%参与者评为最舒适，GrooveSwab?和Nasosorption?分别位列第二和第三。
不同处理方案的回收分析
针对植绒尼龙拭子的初步研究显示，手动混合回收率最低（64 ± 5%），涡旋混合将回收率提高至88 ± 1%，而涡旋加离心组合提供最高回收率（99 ± 1%），体积回收率为95 ± 3%。在更接近实际采集条件的沉积样本实验中，涡旋法回收率为85 ± 4%，涡旋加离心为98 ± 4%，而无缓冲液离心方案的蛋白回收率显著较低（21 ± 1%），证实缺乏回收缓冲液严重限制蛋白从装置释放。对于GrooveSwab?，所有方案均未获得80%以上的回收率，涉及离心和样本转移的方案出现明显蛋白损失和线性度降低。免冷冻无缓冲液离心方案相比含冷冻步骤的等效方案，线性度（R2 0.992 vs. 0.861）和蛋白回收率（47 ± 3% vs. 22 ± 6%）均提高。对照实验（无采集装置）显示蛋白回收率超过99%，表明处理耗材和冻融步骤单独不会导致可测量的GFAP损失。对于Nasosorption?，所有评估方案均导致线性度和蛋白回收率不佳，其致密编织样结构可能截留蛋白，涡旋加离心方案的体积回收率（88 ± 3%）显著低于植绒拭子（95 ± 3%）。
真实样本分析与进一步可能性
对4名卒中患者NE样本的初步概念验证评估中，植绒尼龙拭子和GrooveSwab?在各患者样本中产生一致的GFAP浓度，而Nasosorption?拭子仅有一个样本超过检测限且浓度显著较低。此外，研究提出了一种基于弹击的简单一步回收方案用于GrooveSwab?，可避免稀释。对于Nasosorption?，研究展示了其作为侧向流动免疫测定（LFIA）集成组件的可行性，SARS-CoV-2阳性样本的检测线与qPCR结果一致。
五、讨论与结论
讨论部分指出，植绒尼龙拭子在各种方案中始终优于其他装置，其刷状结构（数千根垂直尼龙纤维）促进毛细摄取同时保持开放通道以利于蛋白高效洗脱，结合柔性杆提高患者舒适度，使其非常适合NE采样和GFAP回收。GrooveSwab?基于表面张力的采集机制和小收集体积可能导致洗脱不完全和对操作损失的敏感性增加，但可能适用于高蛋白样本的简化方案。Nasosorption?的多孔毛细驱动纤维结构可能截留蛋白，限制其在低浓度蛋白分析中的应用，但在传染病诊断（靶标分析物浓度较高）中具有潜力。不同回收方案的比较揭示了最小化操作以保持体积与确保从采集材料高效释放蛋白之间的权衡。冻融步骤单独不会导致GFAP回收率可测量降低，GrooveSwab?观察到的差异似乎依赖装置本身，可能与聚丙烯表面长时间接触、表面张力滞留和样本处理有关。研究结论为：植绒尼龙拭子是目前评估装置中最有前景的NE中GFAP测定选择，GrooveSwab?和Nasosorption?拭子具有创新设计，经进一步改进或用于其他诊断应用具有巨大潜力。这些发现可指导分散化、快速、微创鼻采样工作流程的发展，用于急性卒中分诊背景下的GFAP分析。
