在非蛋白氮提取物制备中沉淀酪蛋白大分子肽的方法

《International Dairy Journal》：Approaches for precipitating caseinomacropeptide in the preparation of non-protein nitrogen extracts

　　

摘要

本研究评估了12%（w/v）三氯乙酸（TCA）沉淀法（乳制品行业中广泛用于测定非蛋白氮并计算真蛋白的方法）的特异性。结果表明，该方法使大量肽类保留在溶液中，尤其是在含有酪蛋白宏肽（CMP）的样品中。在甜乳清粉中，使用常规方法将总氮的12%归类为非蛋白氮（NPN），其中约一半的氮来自CMP。将TCA浓度提高至24%（w/v）改善了肽的沉淀；然而，只有加入磷钨酸（PTA）（0.6%，w/v）才能实现CMP的完全沉淀。这些改良方法显著改善了基于肽的物质与非氨基酸来源氮的分离，可能在分析含CMP的样品时（包括凝乳酶乳清和蛋白水解物）具有实用性，在这些样品中真蛋白旨在反映总氨基酸含量。

引言

氮含量测定（结合氮-蛋白转换因子）被广泛用作测定食品蛋白质含量的参考方法。然而，许多食品，包括牛奶、乳制品和配料，也含有不被视为蛋白质的含氮物质（Donovan & Lonnerdal, 1989; Gowen et al., 2026; Wolfschoon-Pombo, 1981）。这一氮含量部分称为非蛋白氮（NPN），若未加以考虑，会显著影响基于氮的蛋白质计算的准确性。目前使用的多数氮-蛋白转换因子最初都是在假设食品中的氮完全来自蛋白质的前提下确定的，因此若未考虑NPN部分，可能会产生错误结果（Jones, 1931; Mariotti et al., 2008）。

虽然牛奶中大部分氮来自其两个主要蛋白组分（酪蛋白和乳清蛋白），但约5%的氮（即NPN部分）由一系列含氮代谢物组成，如尿素、氨、尿酸、核苷酸和游离氨基酸（Gowen et al., 2025; Klein et al., 2010; Rojas-Gómez et al., 2026; Wolfschoon-Pombo, 1981）。通过沉淀蛋白质并测量剩余氮——通常来自低分子量的非蛋白化合物——可获得更精确的"真蛋白氮"测定值。真蛋白氮是通过从总氮中减去NPN计算得出的，不过也可以直接测量由酪蛋白和乳清蛋白组成的蛋白沉淀物（International Dairy Federation, 2016）。凯氏氮分析法通常用于测定总氮和NPN。

在某些国家/地区或应用场景中，牛奶和乳配料中的NPN通常采用三氯乙酸诱导的蛋白沉淀法测定，通常涉及15%（w/v）TCA溶液，与样品混合后最终浓度为12%（w/v）TCA（International Dairy Federation, 2016; Rowland, 1938a, 1938b, 1938c）。虽然"真蛋白氮"目前是根据用于计算它的分析方法定义的（即12% w/v TCA可溶部分分离）（International Dairy Federation, 2016），但在牛奶中，12%（w/v）TCA提取的氮接近3 kDa分子量截留膜上可透析的氮（DeVries et al., 2017）。也可以使用其他沉淀剂，如单宁酸，它是一种危害较小的试剂，并且也能模拟TCA或基于大小的分离法在奶粉中所分离的氮量（DeVries et al., 2017; The United States Pharmacopeial Convention, 2016）。磷钨酸（PTA）也用于某些场景，因为它是一种比TCA或单宁酸强得多的沉淀剂，能够沉淀小肽（Jarrett et al., 1982; Rohm et al., 1994; Stadhouders, 1960）甚至某些氨基酸（Jarrett et al., 1982; Thimann, 1930）。在奶酪蛋白水解分析中，5% PTA溶液与硫酸结合，产生大约由<600 Da化合物来源的氮组成的提取物，使得在成熟过程中能够定量奶酪中的小分子蛋白水解产物（McSweeney & Fox, 1997）。

PTA也被用于识别乳制品中的酪蛋白宏肽（CMP）。与通过酸诱导酪蛋白沉淀或脱脂牛奶微滤获得的乳清不同，奶酪和凝乳酶乳清含有CMP，源自κ-酪蛋白的凝乳酶诱导水解。6.8 kDa亲本肽（即糖宏肽，或GMP）的糖基化部分在12% TCA中大部分可溶，因此会分配至NPN部分（De Koning et al., 1966; Elgar et al., 2020; Nitscnnann & Henzi, 1959）。然而，一些研究（De Koning et al., 1966; Wolfschoon-Pombo & Pinto, 1985）表明，若将PTA加入12% TCA滤液中，可以沉淀GMP。

NPN提取物中存在GMP在蛋白质分析中可能存在问题。许多组织目前将蛋白质定义为蛋白生成性氨基酸的总和（Food and Agriculture Organisation of the United Nations, 2003; World Health Organization, 2019），并不根据多肽链长度来区分蛋白质。CMP是许多乳清来源配方产品中氨基酸的重要来源，这些产品以CMP为主要蛋白来源，包括婴儿配方食品（Jensen et al., 2015; Mollé & Léonil, 2005; Sunds et al., 2019; Thom? et al., 2006）。在这些产品中，当采用常规牛奶氮分离技术时，CMP目前可能被归类为NPN（Elgar et al., 2020; Rizvi & Josephson, 1975）。

在现代营养标准和当代乳制品加工实践的背景下，需要重新评估NPN分离方法，以确保其适用于各种商业生产的乳制品蛋白配料。本研究使用当前的NPN提取方法证明了NPN提取物中存在GMP等大分子肽。此外，本研究还描述了提高NPN提取试剂沉淀效率的实用改良方法，使CMP能够完全沉淀，从而作为真蛋白氮被定量。

章节片段

材料

一种乳清蛋白浓缩粉（34%，w/w，蛋白质），源自切达奶酪生产，从当地供应商处获得，并用于本研究的大部分实验。奶粉从商业制造商处获得，而乳清蛋白水解物（WPH）粉从当地超市获得，除卵磷脂外不含添加剂。生牛乳全脂牛奶取自Teagasc动物与草地研究及Moorepark Dairy Farm。

TCA提取条件对肽溶解度的影响

CMP标准和WPC34的高氯酸可溶部分的HPLC图谱见图2。梯度清晰地分离了WPC34样品中不同的CMP种类，同时也明显观察到一组广泛的GMP峰。GMP峰的广泛范围可能是由于原始κ-酪蛋白蛋白糖基化水平的自然变化（Minikiewicz et al., 1996; Qu et al., 2021; Sunds et al., 2019; Vreeman et al., 1986）；糖基化程度的增加……

讨论

本研究结果表明，在进行氮分离和测量时，甜乳清中的蛋白质分析会产生显著误差。从图5可以看出，当定义为12%（w/v）TCA可溶氮时，WPC34中约12%的氮被测量为NPN，当达到CMP完全沉淀时，这一比例降至约5%。如果粗蛋白被计算为总氮乘以与纯化蛋白相关的氮转换因子（即牛奶为6.38……

结论

总体而言，使用12%（w/v）TCA作为NPN提取剂被发现不足以沉淀甜乳清粉和蛋白水解物中的肽。然而，在使用HCl或TCA酸化后加入0.6%（w/v）PTA，确实实现了CMP的完全沉淀。这种方法似乎具有显著的应用价值，确保NPN沉淀捕获更高产量的氨基酸来源氮，从而减少了基于氮的蛋白质计算中一个显著的误差来源。

CRediT作者贡献声明

Tom F. O'Callaghan：撰写 – 审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。Tim Hoekstra：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，调查，形式化分析，数据整理，概念化。Noel A. McCarthy：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，可视化，资源，项目管理，资金获取，概念化。Thom Huppertz：撰写 – 审阅与编辑……

未引用参考文献

International Organization for Standardization, 2016.

利益冲突声明

? 作者声明以下财务利益/个人关系，可能被视为潜在利益冲突：Timothy Hoekstra报告获得了Dairy Research Ireland的财务支持。Thom Huppertz报告与Royal FrieslandCampina存在关系，包括：雇佣关系。鉴于他作为期刊主编的角色，Thom Huppertz未参与本文的同行评审，也无法获取有关其评审的信息。

致谢

Tim Hoekstra是Teagasc Walsh奖学金获得者（编号2023068），资金由Dairy Research Ireland信托提供。

作者感谢Teagasc技术人员Sheila Cogan、Niamh Barry、Martina O'Brien和Tanaka Munengwa在本研究凯氏消解和滴定工作中所展现的专业技能和细心。

Tim Hoekstra|Tom F. O'Callaghan|Thom Huppertz|Noel A. McCarthy