《International Dairy Journal》：A GC-MS-based untargeted metabolomics approach for the discrimination of Haymilk and Mountain Product labelled milk
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欧盟市场提供多种类型的牛奶，这些牛奶因产地、生产方式、加工技术和品质的不同而有所区分。本研究通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）的低分子量代谢组学方法，探讨了干草奶（HM）、山地产品认证牛奶（MP）与常规生产体系牛奶（超长保质期常规牛奶——ESL，以及高品质常
欧盟市场提供多种类型的牛奶，这些牛奶因产地、生产方式、加工技术和品质的不同而有所区分。本研究通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）的低分子量代谢组学方法，探讨了干草奶（HM）、山地产品认证牛奶（MP）与常规生产体系牛奶（超长保质期常规牛奶——ESL，以及高品质常规牛奶——HQ）之间的差异。不同牛奶类型的代谢物谱既受到各自愿性质量计划所依据的生产规范的影响（包括HM的饲喂规定和MP牛奶的地理产地限制），也受到原奶在零售上市前所采用的巴氏杀菌处理（常规或高温巴氏杀菌）的影响。通过将单变量和多变量统计方法与代谢通路分析相结合，研究人员观察到一些与特定代谢途径（尤其是参与碳水化合物和能量代谢的途径）相关的判别性化合物有助于区分不同零售牛奶类型。特别是，与ESL相比，HM中的肌醇（myo-Inositol）、鲨肌醇（scyllo-Inositol）、岩藻糖、果糖和葡萄糖呈上调表达；而与HQ相比，MP中的某些氨基酸和有机酸（如异亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸、2-羟基戊二酸和乳清酸）呈下调表达。总体而言，这些发现证实了不同零售牛奶类型具有独特的代谢特征，支持了此前的证据，并为乳制品行业中与生产系统和质量标签相关的生化差异提供了额外的见解。
基于GC-MS非靶向代谢组学的零售牛奶类型鉴别研究解读
一、研究背景与意义
牛奶代谢组极为复杂，迄今已鉴定出超过2000种代谢物，其组成受遗传、物种、品种、泌乳阶段等内在因素以及日粮、季节、健康状况和加工技术等外在因素的多重影响。除蛋白质、脂肪和乳糖外，牛奶还含有大量生物活性分子和低分子量化合物，包括糖类、游离氨基酸、有机酸等。这些代谢物来源多样，既可反映乳腺内的生物合成过程，也可反映动物的全身代谢状态，甚至与牧场饲喂策略密切相关。
在欧盟市场，除常规牛奶外，还存在与自愿性质量标志相关的牛奶类型。其中，干草奶（Haymilk，HM）是依据欧盟条例2016/304设立的"传统特色保证"（TSG）产品，其生产规范要求泌乳奶牛日粮中至少75%的粗饲料，并禁止在日粮中使用青贮饲料。另一类为山地产品（Mountain Product，MP）认证牛奶，其生产要求农场位置和饲料来源均须位于山区。此前已有研究通过1H NMR代谢组学成功区分干草奶与青贮饲喂牛奶，但针对这些自愿性认证牛奶与常规牛奶在低分子量极性代谢物层面的系统比较仍较缺乏。
研究人员此前的研究发现，消费者并未感知到这些认证牛奶与常规牛奶在健康、口感或营养方面的差异，这反映了消费者认知的局限，由此产生了两个互补的需求：一是产品真实性鉴别需求，即通过内在标记物验证标签牛奶与声明规范的一致性，防止错误标识；二是产品特征化需求，即可客观测量的成分特征有助于记录这些牛奶的独特性，并在食品信息与声称的监管框架内向消费者传达。然而，此前基于便携式近红外光谱的研究虽能实现快速分类，却无法解析单个分子，难以将分类结果与牛奶的具体化学特征相关联。因此，本研究采用非靶向GC-MS代谢组学方法，从互补的分析维度探究自愿性认证牛奶与常规牛奶在低分子量代谢物层面的差异。
二、研究设计与技术方法
研究人员从意大利洛迪地区的超市采集了80份零售全脂牛奶样品（保质期短于30天），涵盖四种类型：HM、MP两种自愿性认证牛奶，以及作为对照的ESL和HQ两种常规牛奶。每类20份样品，于2022年3月至10月间分20个采样时段（每周一次）采集，每时段四种类型同日购买以保证可比性。样品涵盖7个品牌（HQ五种、ESL三种、HM三种、MP一种）。研究人员采用基于甲氧胺化和三甲基硅烷化衍生化的GC-MS非靶向代谢组学方法，通过PARADISe软件进行色谱解卷积，共鉴定出61种代谢物。统计分析采用双因素方差分析（ANOVA）、主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），并通过MetaboAnalyst进行代谢通路分析。
三、研究结果
3.1 GC-MS分析的零售牛奶代谢组
研究人员通过TMS/MEOX衍生化和GC-MS分析，在牛奶样品中共鉴定出61种代谢物，分为13种游离脂肪酸（含辛二酸和壬二酸两种二羧酸）、9种游离氨基酸及其衍生物、11种有机酸、8种单糖、4种糖酸、5种多元醇和糖醇、2种氨基糖和3种磷酸化化合物，另有6种杂类化合物（尿素、乙醇胺、胞嘧啶、乳清酸、D-泛酸和马尿酸）。代谢通路分析共映射出42条通路，其中5条在FDR校正后仍具有显著统计学意义和高通路影响值：丁酸代谢、半乳糖代谢、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及柠檬酸循环（TCA循环）。
3.2 基于代谢组学特征的牛奶分类
全模型（四类牛奶）采用10个潜变量（LVs），交叉验证的平衡错误率（BER）为0.199。训练集总体准确率达0.99，交叉验证中准确率为0.90。MP牛奶分类最稳健（敏感性0.89，F1分数0.86），HM次之（敏感性0.82，F1分数0.80），而ESL和HQ的敏感性较低（分别为0.72和0.77）。值得注意的是，误分类并非随机，而是倾向于归类到采用相同热处理方式的类别中——HM与ESL（均采用高温短时巴氏杀菌）之间、MP与HQ（均采用常规巴氏杀菌）之间出现交叉误分类。置换检验（1000次）确认所有模型的分类性能均显著优于随机分配（p = 0.01），排除过拟合可能。
成对比较模型中，HM对ESL分类的最佳模型保留3个LVs，交叉验证准确率为0.70；MP对HQ分类的最佳模型保留4个LVs，交叉验证准确率达0.87，MP敏感性为0.91。MP与HQ的区分效果明显优于HM与ESL的区分，这可能是因为HM和ESL所经受的更剧烈热处理部分掩盖了与原料奶生产体系相关的代谢差异。
3.3 判别代谢物
在全模型中，琥珀酸是最具影响力的变量，其次是2-羟基戊二酸、肌醇、丙氨酸和异亮氨酸。Z-score热图显示HQ总体呈现较高相对丰度，而MP以较低水平为主。HM对ESL比较中，肌醇、脯氨酸和鲨肌醇是最重要的判别代谢物；MP对HQ比较中，肌醇VIP值最高，其次是异亮氨酸、半乳糖和甘油酸。肌醇、丙氨酸、半乳糖、己酸和苹果酸在所有PLS-DA模型中均具有最高VIP值。HM对ESL比较中，多数判别代谢物的倍数变化大于1，表明HM样品中普遍上调，其中肌醇、鲨肌醇、岩藻糖、果糖和葡萄糖显著增加（倍数变化1.2至1.7）。MP对HQ比较中，多数判别代谢物倍数变化小于1，表明MP牛奶中整体下调，异亮氨酸、丙氨酸、丝氨酸、2-羟基戊二酸和乳清酸的倍数变化在0.5至0.8之间。
四、讨论与结论
讨论要点
研究人员发现，热处理是牛奶代谢组变异的主要来源之一，但并非唯一因素。HM与ESL、MP与HQ之间的不完全重叠表明，即使经过相同热处理，不同质量标志的牛奶仍保留了与生产体系相关的特定代谢特征。肌醇作为最具判别力的代谢物之一，在HM中相对丰度最高，这与HM生产规范要求的高比例粗饲料（至少75%）和新鲜牧草摄入有关，且肌醇被认为是牛奶中最为稳定的糖类之一，基本不受常规热处理影响。琥珀酸的高VIP值可能反映其作为多种来源（瘤胃发酵、微生物代谢、热处理）共同产物的综合贡献。丙氨酸在HQ中相对富集，可能与其日粮中较高谷物比例相关。与脂肪酸谱不同，游离脂肪酸在四类牛奶间未检测到显著差异，这与此前关于巴氏杀菌奶和ESL奶总游离脂肪酸含量无差异的报道一致。
研究结论
本研究应用非靶向GC-MS方法表征了零售牛奶中极性和低分子量代谢物的特征，并考察了四类牛奶（两类自愿性质量标志牛奶和两类常规生产牛奶）之间的差异。结合单变量和基于偏最小二乘判别分析的化学计量学方法，研究人员实现了按标签对零售牛奶样品的分类，其中TSG干草奶和山地产品认证牛奶的敏感性最高。当通过成对比较控制热处理效应后，山地产品认证牛奶与常规高品质牛奶仍能以较高准确度区分，而干草奶与常规ESL牛奶的分类准确度有所下降。这些发现表明，生产体系特征（包括饲喂相关规范）和原料奶加工共同塑造了牛奶代谢组。与研究人员此前对同一批牛奶脂质部分的研究（差异仅与质量标签相关）不同，本研究结果表明低分子量代谢物对技术加工和农场层面的生产相关因素均敏感。总体而言，本研究证实了不同零售牛奶类型存在独特的化学特征，为理解自愿性质量体系和生产过程（从牧场到市场）相关的生化差异提供了进一步认识。
