气相臭氧处理对Toma Piemontese PDO奶酪皮下区域水溶性代谢物谱的影响：基于1H NMR波谱学的中试工业规模研究

《International Dairy Journal》：Characterization of aqueous extracts from the sub-rind region of Toma Piemontese PDO cheese ripened under gaseous ozone and ambient atmospheric conditions at pilot-industrial scale using 1H NMR spectroscopy

　　

本研究评估了在Toma Piemontese PDO奶酪成熟过程中应用气态臭氧的效果。分析聚焦于从奶酪皮下区域获得的水提物的水溶性代谢物谱，采用1H NMR波谱学。在中试规模条件下，在成熟的前40天（夜间6小时，每周三次）施加表面臭氧化处理（400 ppb，0.856 mg m?3），并在第60天之前分析了奶酪皮下区域水提物，并与未处理样品（CTL，环境大气条件）进行比较。气态臭氧显著影响了成熟过程，稳定了奶酪的代谢基质。臭氧化样品显示出糖发酵受到抑制，并且微生物衍生代谢物（包括GABA、其他游离氨基酸和丁酮）的相对水平较低。总体而言，在两个样品中都观察到谷氨酸和丁酮随时间累积，这进一步强化了它们作为候选老化标志物的适宜性，并与实验室规模的结果一致。

研究背景与目的

Toma Piemontese 是一种传统的意大利奶酪，拥有受保护原产地名称（PDO）认证，其成熟过程对于形成独特感官特性至关重要。然而，在使用生乳生产奶酪时，控制腐败微生物的生长是一大挑战。传统的手动翻转和刷洗方法虽然部分有效，但劳动强度大，且对微生物增殖的控制有限。臭氧作为一种强效杀菌剂，在食品工业中的应用日益受到关注，它能减少对环境有害化学物质的使用，并迅速分解为氧气。此前实验室规模的研究表明，气态臭氧可以抑制Toma Piemontese PDO奶酪中的微生物生长，同时保持其主要品质属性，并对成熟过程中的代谢变化提供了初步见解。本研究的目的是将这一研究扩展到中试工业规模，评估在实际工业条件下，表面施用气态臭氧对Toma Piemontese PDO奶酪水溶性代谢物谱的影响，并验证实验室规模观察到的代谢变化是否能在中试规模得以维持。

研究方法与技术

研究人员采用¹H NMR波谱学进行非靶向代谢组学分析。所有奶酪样品来自同一生产批次，并分配到两个相同的成熟室（各60 m³），分别对应对照组（CTL，环境空气）和臭氧处理组（O₃）。臭氧处理条件为：目标浓度400 ppb（0.856 mg m^?3），每次6小时（夜间22:00至04:00），每周三次，持续至第40天。在成熟期的第0、10、20、30、40、50和60天采集皮下区域（距表皮0.5-1.0 cm深处）的奶酪样品。每个时间点和处理条件，从两个奶酪轮中收集并混合制成复合样品，然后制备水提物。每个复合样品制备六个独立的技术重复用于NMR分析。1D ¹H NMR谱图在Bruker Avance III 400 MHz光谱仪上采集，并使用MetaboAnalyst 6.0进行稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）等统计处理。代谢物鉴定结合了Chenomx NMR Suite、文献数据和二维^1</H-¹H TOCSY实验。

研究结果

3.1. Toma Piemontese PDO奶酪的代谢物谱

通过¹H NMR谱图，研究人员鉴定了奶酪水提物中的多种水溶性代谢物，包括芳香族氨基酸、脂肪族和极性氨基酸、碳水化合物、酮类和有机酸等。

3.2. Toma Piemontese PDO奶酪的表征

对未经处理的对照组（CTL）样品的sPLS-DA分析显示，只有0天和10天的样品形成了独立的簇，而20至60天的样品未明显分离，表明整体代谢矩阵在较早阶段就趋于稳定。谷氨酸（Glu）、丁酮（Butanone）、亮氨酸（Leu）和赖氨酸（Lys）的相对含量随成熟时间逐渐增加。相比之下，臭氧处理组（O₃）的样品在20、30和40天形成了相对不同的簇，表明臭氧处理调节了奶酪的生化演变。在两种处理中，游离氨基酸（FAA）含量的逐渐增加可能源于持续的蛋白水解作用。丁酮的增加则反映了微生物将双乙酰还原为丁酮的酶活性。对照组中苏氨酸（Thr）相对含量的逐渐降低，可能是因为它被用作多种复杂微生物代谢途径的底物。甲酸盐（Formate）在对照组成熟期间相对水平升高，而在臭氧处理组的图谱中也有发现。肌苷（Inosine）在两个组中均有检出，其相对水平在成熟期间有所波动。

3.3. 不同成熟时间点Toma Piemontese PDO奶酪的¹H NMR化学计量学分析

比较对照和臭氧处理样品在成熟后期（30-60天）的差异。sPLS-DA得分图显示，两组样品在各个时间点均显著分离。在30-40天，分离主要由谷氨酸（Glu）的相对含量驱动，对照组中更高，表明其蛋白水解活性更强。在50-60天，即使臭氧处理在第40天停止，两组间的差异依然持续，表明处理产生了持久影响。对照组表现出更成熟的奶酪特征，代谢物谱更为复杂多样。值得注意的是，在第60天，对照组检测到显著的γ-氨基丁酸（GABA）相对量，而臭氧处理组中GABA含量很低，这支持了臭氧处理的高效性。臭氧处理组奶酪的特征是高水平的乳糖、葡萄糖和其他糖类，而对照组这些化合物的相对水平较低，表明臭氧成功调节了发酵微生物群，减缓了残余碳水化合物的消耗，可能有助于延长奶酪的新鲜度。

将数据分为早期（0-30天）和晚期（30-60天）进行分析。在早期阶段，两组的代谢动态相似，但臭氧处理组的变化还额外受到亮氨酸、赖氨酸和丁酮的影响，这可能与臭氧加速蛋白水解有关。在晚期阶段，对照组成熟过程变得高度复杂，而臭氧处理组则表现出更线性、可预测的代谢轨迹，第三主成分仅解释了3.7%的方差。这表明臭氧起到了稳定剂的作用，使得成熟过程主要体现为衰老氨基酸（如Trp和Glu）的积累，而没有发生糖发酵。

结论与讨论

研究表明，在Toma Piemontese PDO奶酪成熟期间应用表面气态臭氧处理，会影响其皮下区域水提物中的化合物谱。臭氧处理调节了奶酪的成熟过程，表现为与微生物活动相关的代谢物（如GABA、其他游离氨基酸和丁酮）积累较少，同时保留了糖分。从第30到第60天，对照组中谷氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸的相对含量高于臭氧处理组，指示了更强烈的蛋白水解变化。因此，臭氧处理可作为一项有效的技术策略，用于调控成熟动力学、确保代谢稳定性、延缓过熟，并最终延长货架期和提高产品质量。这些结果也表明，基于NMR监测的臭氧处理奶酪，有助于优化工业规模的成熟方案和开发定制的保鲜策略。